TSI AGARS: PAMATOJUMS, SAGATAVOŠANA UN LIETOJUMS - BIOLOĢIJA - 2025

SITS agars vai trīskāršā cukurs dzelzs agars ir cieta vide, kas kalpo kā par bioķīmisko testu, lai vadītu sākotnējo noteikšanu Gram negatīvas nūjiņas. Tās pamatā ir esošo cukuru fermentācijas un sērūdeņraža un gāzes ražošanas parādīšana.

Tās sastāvs un pamats ir ļoti līdzīgs Kliglera dzelzs testam ar atšķirību, ka pēdējais satur tikai glikozi un laktozi. Tā vietā, kā norāda nosaukums, trīskāršā cukura dzelzs agars satur trīs fermentējamus ogļhidrātus: glikozi, laktozi un saharozi.

SITS testa attēli ar dažādiem mikroorganismiem A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Avots: Witmadrid, no Wikimedia Commons

Turklāt TSI barotnē ir četri olbaltumvielu atvasinājumi, kas padara to par ļoti barojošu agaru: rauga ekstrakts, gaļas ekstrakts, peptons un proteozes peptons. Tas satur arī melno amonija sulfātu, nātrija tiosulfātu, nātrija hlorīdu, fenola sarkano un agaru.

Mikroorganisma nespēja raudzēt barotnē esošo glikozi nekavējoties izslēdz to no piederības Enterobacteriaceae ģimenei. Tādēļ šis tests ir būtisks, lai izlemtu, kurš identifikācijas ceļš jāveic, lai noteiktu ģints un sugas.

Katra laboratorija izlemj, vai strādāt ar TSI agaru vai ar Kliglera dzelzs agaru.

Pamats

Katrs no savienojumiem pilda funkciju barotnē.

Nātrija hlorīds un agars

Nātrija hlorīds ir nepieciešams, lai uzturētu barotnes osmotisko līdzsvaru. Kamēr agars iegūst stabilu konsistenci.

PH indikators (fenola sarkans)

Sagatavotās barotnes pH tiek līdzsvarots ar 7,3, un pH indikators (fenola sarkans) kļūst dzeltens zem 6,8. Tas nozīmē, ka neliels daudzums skābju, kas rodas, fermentējot cukurus, barotni pārvērtīs no sarkanoranžā līdz dzeltenai.

Ja fermentācija nenotiek, barotne tiks alkalizēta, izmantojot peptonus, pārvēršoties no sarkanoranža uz spēcīgi sarkanu.

Olbaltumvielu atvasinājumi (rauga ekstrakts, gaļas ekstrakts, peptons un proteozes peptons)

Kad baktērijas metabolizē olbaltumvielas, kas atrodas TSI agarā, tiek ražoti amīni, kas bāzē barotni (galvenokārt slīpajā līmenī), jo reakcijai nepieciešams skābeklis. Aminīni rotājumu padara spilgti sarkanu.

Bet tas būs atkarīgs no baktēriju spējas raudzēt ogļhidrātus vai nē.

Ogļhidrātu (glikozes, laktozes un saharozes) raudzēšana

Cukuru fermentācijas izpēte var radīt vairākus attēlus, un katrs no tiem tiek interpretēts atšķirīgi. Testa interpretācija mikroorganismus iedala 3 kategorijās: glikozes nefermentatori, laktozes nefermentatori un laktozes / saharozes fermentatori.

Jāatzīmē, ka glikozes daudzums barotnē ir ierobežots, savukārt laktozes un saharozes koncentrācija ir 10 reizes augstāka.

Enterobakteriju dzimtas baktērijas un citi glikozi fermentējošie mikroorganismi sāks raudzēt šo cukuru, jo tas ir vienkāršākais enerģijas ogļhidrāts.

No otras puses, laktoze un saharoze ir sarežģīti ogļhidrāti, kas jāsadala un jāpārvērš glikozē, lai tie varētu iekļūt Embden-Meyerhof ciklā.

-Mikroorganismi, kas neraudzē glikozi

Ja inokulētais mikroorganisms nespēj raudzēt glikozi, daudz mazāk tas spēs raudzēt citus ogļhidrātus. Tāpēc šeit neveidojas skābes, bet, izmantojot peptonus, konusā veidojas amīni.

Šajā gadījumā slīpā mala kļūst stiprāk sarkanā krāsā, un mēģenes apakšdaļa var palikt nemainīga vai arī tā var būt alkalizēta, atstājot visu cauruli sarkanu.

Interpretācija: K / K nozīmē sārmainu slīpumu / sārmu vai neitrālu dibenu

Attēlā raksta sākumā skatīt caurules D attēlu.

Šis rezultāts norāda, ka mikroorganisms nepieder pie Enterobacteriaceae dzimtas.

-Mikroorganismi, kas neraudzē laktozi / saharozi

Ja baktērijas spēj raudzēt glikozi, bet ne laktozi vai saharozi, notiks šādi gadījumi:

Baktērijas patērēs visu esošo glikozi apmēram pēc 6 līdz 8 stundām, paspējot paskābināt gan slīpumu, gan bloku; tas ir, agars būs pilnīgi kļuvis dzeltens. Bet, kad glikoze ir izsmelta un nevar izmantot laktozi un saharozi, baktērijas sāks olbaltumvielu metabolismu.

Šai reakcijai nepieciešams skābeklis, tāpēc peptoni noārdās uz virsmas (slīpa). Izgatavotie amīni sārmina rāmi, kļūstot no dzeltenas līdz sarkanai. Par šo reakciju liecina pēc 18 līdz 24 stundu inkubācijas.

Interpretācija: K / A nozīmē sārmu slīpo un skābo vati.

Attēlā raksta sākumā skatiet caurules B attēlu.

-Laktozi / saharozi fermentējošie mikroorganismi

Mikroorganismi, kas spēj raudzēt laktozi un saharozi, acīmredzami var raudzēt glikozi. Pēc tam, kad ir izsmelts minimālais barotnē esošā glikozes daudzums, izveidotais piruvāts sāk metabolizēties, veidojot skābes Kreba aeroba cikla laikā, un 8 līdz 12 stundu laikā visa barotne būs dzeltena.

Ja baktērijas spēj sadalīt laktozi vai saharozi, skābes turpinās ražoties, un pēc 18 līdz 24 stundām visa caurule - slīpa un spraudnis - turpinās dzeltenā krāsā.

Jāatzīmē, ka glikozi lieto divos veidos: viens aerobā virzienā uz mēģenes slīpumu un otrs anaerobi mēģenes apakšā.

Interpretācija: A / A nozīmē skābi slīpi / skābi dibeni. Tam var būt vai nav gāzes.

Attēlā raksta sākumā skatīt A caurules attēlu.

Gāzes ražošana

Daži mikroorganismi spēj ražot gāzi cukuru fermentācijas laikā. Par gāzi caurulē liecina spiediens, ko tā izdara agarā. Spiediens izraisa burbuļu veidošanos vai agara pārvietošanos. Dažreiz gāzes veidošanās var sašķelt barotni.

Ir svarīgi, lai SITS barotnes sēšanas laikā punkciju tīri izdara caur agara centru, līdz tā nonāk apakšā. Ja punkcija tiek novirzīta uz mēģenes sienām, tas var radīt nepatiesus pozitīvus rezultātus gāzes ražošanā, jo tas izkļūst caur nepareizi izveidotu kanālu.

Gāzes ražošanai, kā arī reakcijām, kas notiek agara slīpumā, ir nepieciešams skābeklis, tāpēc mēģeni ieteicams pārklāt ar kokvilnas spraudni, un, ja tiek izmantots Bakelīta vāciņš, tam nevajadzētu būt pilnīgi cieši pievilktam.

Par gāzes ražošanu ziņo kā pozitīvu (+) vai negatīvu (-).

Gāzu veidošanās veidi. Avots: MSc veidota shēma. Marielsa Gil. Attēla avots: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, izmantojot Wikimedia Commons

Nātrija tiosulfāts un melnā amonija sulfāts

Baktērijas, kas spēj radīt sērūdeņradi (bezkrāsainu gāzi), ņem sēru no barotnē esošā nātrija tiosulfāta. Pēc tam, kad H ₂ S veidojas, tas reaģē ar dzelzs amonija sulfāta, kas ražo dzelzs sulfīds (skaidri redzams melns nogulsnes).

H ₂ S produkciju uzrāda kā pozitīvu (+) vai negatīvu (-).

Attēlā raksta sākumā skatiet caurules C attēlu.

Sagatavošana

Nosver 62,5 g dehidrēta trīskāršā cukura dzelzs agara (TSI) barotnes un izšķīdina vienā litrā destilēta ūdens.

Karsē, līdz agars ir pilnībā izšķīdis. Vāra minūti, bieži maisot. Sadaliet 4 ml barotnes 13/100 mēģenēs ar kokvilnas vāciņiem.

Sterilizējiet 15 minūtes autoklāvā 121 ° C temperatūrā. Noņemiet no autoklāva un ļaujiet tai atpūsties leņķī. Jāuzmanās, lai gan pamatnei, gan rāmim būtu vienāds attālums.

Uzglabāt ledusskapī 2-8 ° C temperatūrā. Pirms baktēriju celma sēšanas ļaujiet tam sasilt.

Dehidrētās barotnes krāsa ir gaiši bēša, un sagatavotā barotne ir sarkanoranži.

Sagatavotās barotnes galīgais pH ir 7,3 ± 0,2.

Lietojumprogrammas

SITS testu plaši izmanto mikrobioloģijas laboratorijas līmenī. Šis tests ir būtisks, lai vadītu testa veidu, kas jāveic, lai identificētu ģints un sugas. Tā laba izpilde un interpretācija var ietaupīt materiālus un darbaspēku.

Ja rezultāts ir TSI K / K un citohroma oksidāzes tests ir pozitīvs, ir zināms, ka testi ir jāizmanto nefermentējošu gramnegatīvu stieņu, piemēram, Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, identificēšanai citu ģinšu starpā. Ja tas ir oksidāzes negatīvs, tas ir orientēts uz Acinetobacter, Stenotrophomonas ģintīm utt.

No otras puses, ja tiek iegūta SITS A / A vai K / A un citohroma oksidāzes tests ir negatīvs, jo vairāk nitrātu samazinās līdz nitrītiem, mēs būsim pārliecināti, ka tas ir mikroorganisms, kas pieder Enterobacteriaceae ģimenei. Šajā gadījumā identifikācijas ceļš koncentrēsies uz īpašiem šīs baktēriju grupas testiem.

No otras puses, ja tiek iegūts K / A vai A / A attēls un citohroma oksidāzes tests ir pozitīvs, papildus veicamie testi būs paredzēti, lai identificētu fermentācijas celmus, kas nepieder Enterobacteriaceae ģimenei, piemēram: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio un Pasteurella.

SITS ar oksidāzes negatīvu sērūdeņradi palīdzēs identificēt šādas Enterobacteriaceae dzimtas ģintis: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella vai Salmonella.

TSI ar nelielu vai mērenu sērūdeņraža līmeni sārmainā slīpumā ar sārmainu fonu un pozitīvu oksidāzi palīdzēs izmantot testus, lai identificētu nefermentējošos H ₂ S ražojošos gramnegatīvos stieņus, piemēram, Shewanella putrefaciens.

Visbeidzot, SITS var izmantot sērūdeņraža ražošanas izmeklēšanai grampozitīvās baktērijās, īpaši, ja ir aizdomas par Erysipelothrix rhusiopathiae.

Sēj

SITS barotnei jābūt inokulētai ar tīrām kolonijām, kas izolētas primārajās vai selektīvajās kultūrās. Ja kolonija tiek ņemta no selektīvām barotnēm, kuras tika iesētas ar paraugiem ar jauktu floru, jāuzmanās, lai tos ņemtu tikai no virsmas, jo kolonijas apakšējā daļā var būt dzīvotspējīgi celmi, kas inhibēti šajā barotnē.

Tāpēc cilpu nekad nedrīkst atdzesēt uz selektīvās barotnes, un pēc tam koloniju uzņem un inokulē ar SITS barotni.

Sēšana tiks veikta ar taisnu cilpu vai adatu. Tiks veikta punkcija, rūpējoties, lai tā tiktu cauri vidusdaļai, līdz tā nonāk apakšā, un pēc tam sēšanu pabeidz, inokulējot virsmu zigzaga formā. Neveiciet divus punkcijas.

Inkubē aerobiozē 37 ° C temperatūrā 18–24 stundas. Interpretējiet šajā laikā, ne pirms, ne pēc tam.

Ierobežojumi

SITS tests jānolasa 18 līdz 24 stundu laikā pēc inkubācijas. Nolasījums pirms šī laika var sniegt kļūdaini pozitīvu A / A fermentāciju. Tā kā nolasījums pēc šī laika var izraisīt kļūdaini negatīvu nefermentētāja tēlu peptonu patēriņa dēļ, kas sārmaina barotni.

Atsauces

1. Mac Faddin J. (2003). Bioķīmiskie testi klīniski nozīmīgu baktēriju identificēšanai. 3. ed. Redakcija Panamericana. Buenosairesa. Argentīna.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Beilija un Skota mikrobioloģiskā diagnostika. 12 ed. Redakcija Panamericana SA Argentīna.
3. Konemans E, Allens S, Janda V, Šrekenbergers P, Vins V. (2004). Mikrobioloģiskā diagnostika. 5. ed. Redakcija Panamericana SA Argentīna.
4. "TSI agars." Wikipedia, bezmaksas enciklopēdija. 2018. gada 10. jūlijs, 08:09 UTC. 2019. gada 10. februāris, 03:33 Pieejams vietnē: es.wikipedia.org
5. Britannia laboratorijas. TSI agars (trīskāršs cukura dzelzs agars). 2015.Pieejams vietnē: britanialab.com
6. BD laboratorijas. Trīskāršs cukura dzelzs agars (TSI agars). 2003.Pieejams vietnē: bd.com