MÜELLERA HINTONA AGARS: PAMATS, SAGATAVOŠANA UN PIELIETOJUMS - BIOLOĢIJA - 2025

Mueller Hinton Agar nav selektīvs, ciets barotnes sastāv no gaļas infūzijas, peptona skābā kazeīna, cietes, agar un destilētu ūdeni. Šī barotne nodrošina izcilu mikrobu augšanu lielākajai daļai strauji augošo baktēriju.

Sākotnēji to izveidoja Džons Hovards Mīlers un Džeina Hintone, lai izolētu uzturvielu prasīgās baktērijas, piemēram, Neisseria gonorrhoeae un Neisseria meningitidis. Tomēr tā īpašību dēļ tas izrādījās ideāli piemērots jutības pret antibiotikām pētījumiem, nodrošinot ticamus un reproducējamus rezultātus.

Antibiogrammas (Müeller Hinton agar). Avots: Dr Graham Beards vietnē en.wikipedia

Tādēļ Müellera Hintona agars ir barotne, ko pieņēmusi Klīnisko un laboratorisko standartu institūts (CLSI) un Eiropas Antimikrobiālās jutības pārbaudes komiteja, lai veiktu pretmikrobu jutības testu ar Kirbija diska difūzijas metodi un Bauers.

Pamats

Tā kā barības vide ir neselektīva, tā ir lieliska patogēno baktēriju augšanai.

No otras puses, tā vienkāršais sastāvs padara vielas viegli uz tā difūzu, kas ir būtisks raksturlielums jutības pārbaudē ar diska difūzijas metodi.

Vēl viena no tā īpašībām ir tā, ka tajā ir neliels daudzums inhibitoru, kas ļauj efektīvi novērtēt sulfonamīdus, trimetoprimu un tetraciklīnus.

Tomēr jāpatur prātā, ka videi jāatbilst noteiktiem nosacījumiem, lai nodrošinātu tā pareizu darbību, tostarp:

PH, agara dziļuma un atbilstošās timīna, timidīna, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ un Zn ⁺⁺ koncentrācijas pielāgošana .

Jums arī jāzina, ka metodika ir standartizēta, un tāpēc ir jāatbilst visiem parametriem, piemēram:

Sējmateriāla koncentrācija, antibiotiku disku koncentrācija un saglabāšana, atbilstoša skaita disku ievietošana agarā, attālums starp vienu disku un noteiktu antibiotiku stratēģiskais izvietojums, atmosfēra, temperatūra un laiks inkubācija.

Sagatavošana

Nosver 37 g dehidrētas Müeller Hinton barotnes un izšķīdina 1 litrā destilēta ūdens. Maisot karsē barotni, lai veicinātu izšķīšanu. Vāra 1 minūti.

Autoklāvs 15 minūtes sterilizē 121 ° C temperatūrā. Izņemot no autoklāva, kolba jānovieto ūdens vannā 50 ° C temperatūrā, lai tā atdziest. Ielejiet 25 līdz 30 ml sterilos Petri trauciņos ar diametru 10 cm.

Plātnēm jābūt ar vidējo biezumu 4 mm (ideāli), ar pieļaujamo diapazonu 3-5 mm.

Ja vēlams pagatavot asins agaru, par pamatu izmantojot Müeller Hinton agaru, pirms pasniegšanas uz plāksnēm ielej 5% sterilu un defibrētu jēra asiņu.

Barotnes galīgajam pH vajadzētu būt no 7,2 līdz 7,4.

Ieguldiet un uzglabājiet ledusskapī līdz lietošanai. Pirms lietošanas plāksnei ļauj sasilt līdz istabas temperatūrai.

Sagatavotās barotnes krāsa ir gaiši bēša.

Lietojumprogrammas

To izmanto, lai veiktu pretiogrammu vai jutības pret antibiotikām testus visstraujāk augošajiem patogēniem, kas nav prasīgi.

Ja agars tiek papildināts ar asinīm, to izmanto, lai veiktu tādu mikroorganismu, kā: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, antibakteriālo shēmu. To izmantoja arī Legionella pneumophila izolēšanai.

Antibiogrammas tehnika

Pirms veicot antibiogram bakteriālā šķīdums, kas atbilst 1,5 x 10 ⁸ šūnu jābūt gatavai .

Šim nolūkam ņem 3 līdz 4 tīras kultūras kolonijas un suspendē sojas pupu trypticase buljonā vai Müeller Hinton buljonā, inkubē no 2 līdz 6 stundām un koncentrāciju pielāgo ar sterilu fizioloģisko šķīdumu, salīdzinot to ar Mac Farland standartu 0,5%.

Ja tie prasa mikroorganismus, kolonijas var suspendēt tieši līdz koncentrācijai 0,5% Mac Farland. Pēc tam Müeller Hinton plāksni iesēj ar tamponu, kas piesūcināts ar sagatavoto baktēriju šķīdumu.

Lai to izdarītu, tamponu iegremdē šķīdumā un pēc tam lieko šķidrumu noņem, nospiežot pret mēģenes sienām. Tūlīt pēc tam tamponu izlaiž pa visu virsmu, nepaliekot nevienu vietu neskartu, tad plāksni nedaudz pagriež un atkal iesēj. Operāciju atkārto vēl 2 reizes.

Ļaujiet nostāvēties 10 minūtes un pēc tam ievietojiet antibiotiku diskus ar sterilu knaiblīti, atstājot starp tiem 24 mm atstarpi. Pēc katra diska ievietošanas agarā viegli saspiediet katru disku ar knaiblēm, lai pārliecinātos, ka tie labi pielīp.

Kad process ir pabeigts, plāksni apgriež un inkubē 35–37 ° C temperatūrā aerobiozē 16–18 stundas. Ja tas ir prasīgs mikroorganisms, tas var būt pelnījis mikroaerofiliju, un, ja antiiogrammā ir oksacilīna diski, tas jālasa pēc 24 stundām.

Katra halo diametra mērīšanai tiek izmantots lineāls. Rezultāti jāreģistrē mm. Pēc tam iegūtās vērtības tiek korelētas ar robežpunktu tabulām, kas publicētas pašreizējā CLSI rokasgrāmatā.

Inhibīcijas halo mērīšana. Avots: USCDCP, Pixnio.com

Ziņo par jutīgu (S), par vidēju (I) vai par izturīgu (R) atkarībā no gadījuma.

Antibiotikas izvēlas atkarībā no izolētā mikroorganisma un tā radītā infekcijas veida.

Dažreiz jāpatur prātā antibiotiku stratēģiskā izvietošana, lai atklātu fenotipiskos rezistences modeļus.

Stratēģiskā diska izvietojums Müellera Hintona agarā

Enterobaktērijām klavulānskābes disks jānovieto pret 3. un 4. paaudzes cefalosporīniem. Olu formas paplašināšanās norāda, ka celms ir paplašināta spektra beta-laktamāžu (ESBL) ražotājs. Tas nozīmē, ka pacientu nedrīkst ārstēt ar cefalosporīniem.

Paplašināta spektra beta-laktamāzes (ESBL) ražošanas fenotipiskā ekspresija Escherichia coli celmā. Avots: Autores uzņemts foto MSc. Marielsa gil

Stafilokokā ir svarīgi novietot eritromicīna vai azitromicīna disku klindamicīna diska priekšā (D-tests).

Rezistenta hala eritromicīnā un saplacināšanās halodamicīna halogenīnā norāda, ka celmam ir celma inducējama klindamicīna rezistence (ICR). Tas nozīmē, ka klindamicīna terapija nebūs efektīva.

Lai meklētu inducējamus AMP C celmus Enterobacteriaceae un dažiem nefermentējošiem gramnegatīviem stieņiem, tazobaktāna ceftazidīma, cefoksitīna vai piperacilīna diski ir saskarti ar imipenēma disku 27 mm attālumā.

Saplacināts halors vienā no diskiem, kas vērsti pret imipenēmu, norāda uz indukcijas AMP C klātbūtni.

Konstitutīva C-AMP meklēšanai 500 μg kloksatsilīna diska 25 mm attālumā saskaras ar ceftazidīmu (30 μg) un ar cefotaksīmu (30 μg). Paplašināts halogēna daudzums kādā no cefalosporīniem norāda uz pozitīvumu.

Kloksacilīna disku var aizstāt arī ar 9 mm disku Whatman Nr. 6 filtrpapīru, kas piesūcināts ar fenilborskābi (400 μg), ar attālumu 18 mm. To interpretē tāpat kā iepriekšējo.

Visbeidzot, lai izpētītu metallobetalaktamāziju veidošanos, jo īpaši Pseudomonas aeruginosa, tiek izmantots disks, kas piesūcināts ar 10 μl etilēndiamīntetraetiķskābes (EDTA 750 μg) un tioglikolskābes (SMA 300 μg), kas saskaras ar imipenēma un meropenēma diskiem, 15 mm attālumā.

Tests ir pozitīvs, ja imipenēma vai meropenēma halos ir paplašinājies virzienā uz EDTA / SMA disku. Šis rezultāts jāapstiprina ar modificēto Hodžes testu.

Šī metode sastāv no Escherichia coli ATCC 25922 celma inokulācijas Müeller Hinton plāksnē. Plāksnes centrā tiek ievietots imipenēma disks, un pēc tam no diska uz perifēriju tiek veidota svītra ar iespējamo P. aeruginosa celmu. Vienā plāksnē var pārbaudīt ne vairāk kā 4 celmus.

Pārbaude būs pozitīva, ja ap striju būs imipenēma halo sagrozīšanas zona.

Kļūdainu rezultātu cēloņi

- Slikti konservēti antibiotiku diski var radīt viltus rezistenci. Piemēram, oksacilīna disks ir ļoti jutīgs pret temperatūras izmaiņām.

-Vides barotnes pH zem norādītā (skābā) rada mazākus halogenus aminoglikozīdos un makrolīdos (viltus rezistences risks) un lielākus halogenus penicilīnā, tetraciklīnā un novobiocīnā (viltus jutības risks).

-Ja pH ir augstāks par norādīto (sārmains), iepriekš aprakstītā iedarbība tiek mainīta.

-Mēdiji ar augstu timīna un timidīna koncentrāciju ietekmē, ievērojami samazinot sulfonamīdu un trimetoprima inhibīciju halos.

- Augsta kalcija un magnija koncentrācija rada nepatiesu aminoglikozīdu, polimiksīna B un tetraciklīnu izturību pret Pseudomonas aeruginosa celmiem.

-Zema kalcija un magnija koncentrācija rada nepatiesu aminoglikozīdu, polimiksīna B un tetraciklīnu jutīgumu pret Pseudomonas aeruginosa celmiem.

-Cinka klātbūtne ietekmē karbapenēma disku (imipenēma, meropenēma un ertapenēma) rezultātus.

-Vidnes biezums zem 3 mm radīs nepatiesu jutības rezultātu, savukārt biezums virs 5 radīs nepatiesu pretestību.

- Disku mobilizācija antiiogrammā radīs deformētas haloskābes, jo antibiotiku izdalīšana notiek nekavējoties.

- Ļoti vāji inokulāti ietekmē rezultātus, jo agarā nebūs vienmērīga vai saplūstoša augšanas - tas ir nepieciešams nosacījums, lai varētu izmērīt kavējošās halozes, papildus tam, ka halozes var dot lielākas nekā parasti.

-Pievienoti sējmateriāli var dot mazākas halozes nekā parasti.

- Neievērojot attālumu starp diskiem, viens halors pārklājas ar otru, un tos nevar pareizi nolasīt.

-Incubate ar CO ₂ pieaugumu lieluma Halos tetraciklīna un pret meticilīnu disku.

-Inkubēt temperatūrā, kas zemāka par 35 ° C, veidojas lielāki halozi.

-Pievienojot asinis, samazinās sulfahalora lielums.

Ierobežojumi

Antibiogrammā parādītā antibiotikas jutība pret mikroorganismu (in vitro) negarantē, ka tā darbosies in vivo.

QA

Lai uzzinātu, vai barotne satur pietiekamu daudzumu timīna, jāstāda Enterococcus faecalis ATCC 29212 celms un jāpārbauda jutība pret trimetoprima sulfametoksazolu (SXT), tai jādod halogenu, kas vienāds vai lielāks par 20 mm, lai būtu apmierinošs.

Atsauces

1. "Müller-Hinton agars." Wikipedia, bezmaksas enciklopēdija. 2018. gada 16. novembris, 12:23 UTC. 2019. gada 27. janvāris, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Beilija un Skota mikrobioloģiskā diagnostika. 12 ed. Redakcija Panamericana SA Argentīna.
3. Cona E. Nosacījumi laba uzņēmības pētījumam ar agara difūzijas testu. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo laboratorija. Müeller Hinton agars ar 5% aitu asiņu. 2009.Pieejams vietnē: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II agara laboratorija. 2017.Pieejams vietnē: .bd.com
6. Britannia laboratorijas. Müellera Hintona agars. 2015.Pieejams vietnē: britanialab.com
7. Konemans E, Allens S, Janda V, Šrekenbergers P, Vins V. (2004). Mikrobioloģiskā diagnostika. 5. ed. Redakcija Panamericana SA Argentīna.
8. Martínez-Rojas D. AmpC tipa betalaktamāzes: fenotipiskā noteikšanas vispārinājumi un metodes. Soc. Ven. Mikrobiols. 2009. gads; 29 (2): 78.-83. Pieejams vietnē: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Metallobetalaktamazmu fenotipiska noteikšana Pseudomonas aeruginosa klīniskajos izolātos. Kasmera, 2012; 40 (2): 113–121. Pieejams vietnē: scielo.org.