STANDARTA AGARA LODĪTES: PAMATOJUMS, SAGATAVOŠANA UN PIELIETOJUMS - BIOLOĢIJA - 2025

Standarts skaits agars ir cieta, nav selektīva barotne, kas paredzēti, lai kvantitatīvi noteiktu aerobo mikrobu slodzes Šobrīd paraugos dzeramā ūdens, notekūdeņu, piena dzērieni, kā arī citiem pārtikas produktiem. Šī barotne ir pazīstama arī kā PCA agars ar savu akronīmu angļu valodā Plate Count Agar. To 1953. gadā izveidoja Buchbinder, Baris un Goldstein.

Standarta agara barotni veido rauga ekstrakts, tripteins, glikoze, agars un destilēts ūdens. Šis sastāvs satur pamata uztura elementus, kas ļauj attīstīt pašreizējo aerobo mikrobu slodzi, nav prasīga.

Decimālie atšķaidījumi CFU skaitīšanai standarta agara skaitā. Avots: Kventina Geismane

Tā kā barotne nesatur inhibitorus, baktērijas var augt bez jebkādiem ierobežojumiem, padarot to par ideālu vispārēju koloniju skaitīšanai. Tomēr plākšņu kvantitatīvā noteikšanas metode neatklās visas klātesošās baktērijas, bet tikai tās, kuras spēj augt vides apstākļos, kuriem pakļauts iesēts standarta agars.

Šajā ziņā plākšņu kvantitatīvās noteikšanas tehnika parasti cenšas noteikt aerobā mezofilā tipa baktēriju daudzumu, tas ir, tās, kas aug temperatūrā no 25 līdz 40 ° C, ar optimālo augšanas temperatūru 37 ° C. .

Šī baktēriju grupa ir ļoti svarīga, jo tur atrodama lielākā daļa cilvēku patogēno baktēriju.

Jāatzīmē, ka dažreiz var būt interesanti noteikt psirofilo baktēriju daudzumu pārtikā. Šīs baktērijas ir tās, kas aug zemā temperatūrā (<20 ° C) un ir atbildīgas par pārtikas ātrāku sadalīšanos pat atdzesētā stāvoklī.

Tāpat termofīlās baktērijas, kas attīstās diapazonā no 50 ° C līdz 80 ° C vai vairāk, var būt nozīmīgas dažu veidu pārtikā, piemēram, konservos.

Mikrobu kvantitatīvo noteikšanu izsaka koloniju veidojošās vienībās (CFU) uz gramu vai mililitru parauga.

Pamats

Standarta skaitīšanas barotne ir izstrādāta, lai ļautu sekmīgi augt neveicīgām aerobām baktērijām, jo ​​rauga ekstrakts, tripteins un glikoze nodrošina nepieciešamās barības vielas labai mikrobu augšanai.

No otras puses, barotnei ir gaiša krāsa un caurspīdīgs izskats, tieši tāpēc tā ir ideāli piemērota koloniju vizualizēšanai, kas izveidotas ar dziļās sēšanas metodi (plātnes liešana).

Ir iespējama arī koloniju skaitīšana ar Drigalski lāpstiņas virsmas sēšanas metodi.

Ja mikrobu slodze ir liela, jāveic CFD skaita laboratorijas paraugi ar atšķaidījumu pa decimāldaļām.

Jāatzīmē, ka šo barotni aerobisko mezofilu skaita noteikšanai iesaka Amerikas Sabiedrības veselības asociācija (APHA).

Sagatavošana

Nosver 23,5 g dehidrētas barotnes un izšķīdina litrā destilēta ūdens. Lai pilnībā izšķīdinātu, maisījums jāuzsilda, bieži maisot, līdz tas sāk vārīties. Turpmākās darbības ir atkarīgas no izmantojamās sēšanas tehnikas.

Papildu plāksnes tehnikai

Izplatiet, mēģenēs izdalot 12 līdz 15 ml. Pēc tam 15 minūtes sterilizē autoklāvā 121 ° C temperatūrā. Ļauj vertikāli sacietēt bloka formā. Līdz lietošanai uzglabāt ledusskapī.

Kad gatavojaties to izmantot, izkausējiet kontaktdakšu. Kad paraugi ir izkusuši, turiet to ūdens vannā 44–47 ° C temperatūrā, kamēr paraugi tiek sagatavoti.

Virszemes sējai

Sterilējiet barotni autoklāvā 121 ° C temperatūrā un pēc tam izdaliet 20 ml sterilos Petri traukos. Ļaujiet sacietēt, apgrieziet to un uzglabājiet ledusskapī līdz lietošanai.

Pirms lietošanas atlaidina plātnes. Barotnes pH jābūt 7,0 ± 0,2.

Izmantojiet

Standarta agars tiek izmantots aerobās mezofilās skaitīšanas tehnikā ūdens un pārtikas mikrobioloģiskās analīzes laikā. Aerobisko mezofilu skaits ir nepieciešams, jo tas nosaka pētāmā parauga sanitāro kvalitāti.

Šīs tehnikas izmantošana (izmantojot šo barotni) ļauj makroskopiski vizualizēt izolētās kolonijas to kvantitatīvai noteikšanai.

Plātņu ieliešanas tehnika (dziļuma sēšana)

-Procesu

Metode sastāv no:

1) Homogenizē paraugu, lai pārdalītu esošās baktērijas.

2) Sākotnējo suspensiju sagatavo sterilā pudelē vai maisā, ievērojot attiecību 10 gr vai 10 ml parauga 90 ml atšķaidītāja (10 ^-1 ).

3) No sākotnējās suspensijas atkarībā no parauga veida veic attiecīgos decimālos atšķaidījumus. Piem .: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Atšķaidījumus veic ar peptona ūdeni vai fosfāta buferšķīdumu.

Lai to izdarītu, ņem 1 ml sākotnējās suspensijas un ievieto to 9 ml atšķaidītāja, vajadzības gadījumā turpina atšķaidīšanu, tagad ņemot 1 ml no 10 ^-2 atšķaidījuma utt.

4) Ņem 1 ml katra atšķaidījuma un ievieto tukšos, sterilos Petri trauciņos.

5) Katrai plāksnei pievieno 12 līdz 15 ml standarta agara, kas iepriekš izkusis un nostādināts 44 - 47 ° C temperatūrā.

6) Viegli pagrieziet plāksnes, lai paraugs vienmērīgi sadalītos pa agaru un ļautu tam sacietēt.

7) Apgrieziet plāksnes un inkubējiet aerobiozē 37 ° C temperatūrā 24 līdz 48 stundas.

8) Pēc laika plāksnes pārbauda un kolonijas saskaita atšķaidījumā, kas to ļauj. Skaitīšanai tiek izvēlētas tās plāksnes, kurās ir no 30 līdz 300 CFU.

Skaitīšanu var veikt manuāli vai arī koloniju skaitītāja aprīkojumu.

1 ml parauga pieļaujamās vērtības dažādās valstīs var atšķirties atkarībā no noteikumiem, kurus tās regulē.

-UFC aprēķins

Vispārīgo aprēķinu veic, izmantojot šādu formulu:

Formula CFU kvantificēšanas vispārīgam aprēķinam. Avots: Zāļu, pārtikas un medicīnas tehnoloģiju valsts pārvalde (ANMAT). Pārtikas mikrobioloģiskā analīze, oficiālā analītiskā metodika, indikatoru mikroorganismi. 2014. gada 3. sējums. Pieejams vietnē: anmat.gov.ar

Rezultātus izsaka ar 1 vai 2 cipariem, reizinot ar atbilstošo bāzi 10. Piemērs: ja rezultāts ir 16,545, to noapaļo, pamatojoties uz trešo ciparu līdz 17 000, un to izsaka šādi: 1,7 x 10 ⁴ . Tagad, ja rezultāts būtu 16 436, noapaļojiet to līdz 16 000 un izteiktu 1,6 x 10 ⁴ .

Virsmas sēšanas tehnika

-Procesu

-Inokulāri ar 0,1 ml tiešā parauga, ja tas ir šķidrs, sākotnējā suspensija 10 ^-1 vai secīgi atšķaidījumi 10 ^-2 , 10 ^-3 utt., Standarta skaitīšanas agara plates centrā.

- Paraugu vienmērīgi sadaliet ar Drigalski lāpstiņu vai L formas stikla stieni un ļaujiet tai 10 minūtes atpūsties.

- Apgrieziet plāksnes un inkubējiet aerobi 37 ° C temperatūrā 24 līdz 48 stundas.

- Lai kolonijas saskaitītu, izvēlieties tās plāksnes, kuru diapazons ir no 20 līdz 250 CFU.

-UFC aprēķins

Aprēķinam tiek izmantots atšķaidīšanas koeficients, kas ir apgriezts. Skaitli noapaļo līdz 2 zīmīgiem cipariem (noapaļojot pēc trešā cipara), un to izsaka ar bāzes 10 jaudu. Piemēram, ja paraugā bez atšķaidīšanas tiek skaitīti 224 CFU (10 ^-1 ), tiek ziņots par 22 x 10 ¹ CFU , bet, ja skaitlis būtu 225, tiek ziņots par 23 x 10 ¹ CFU.

Tagad, ja 10 ^-3 atšķaidījumā tiek ieskaitīti 199 CFU, tiks ziņots par 20 x 10 ⁴ CFU, bet, ja tajā pašā atšķaidījumā tiks ieskaitīti 153 CFU, tad tiks ziņots par 15 x 10 ⁴ CFU.

QA

Standarta kultūras barotni var novērtēt, izmantojot zināmus sertificētus celmus, piemēram: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri.

Ja barotne ir optimālos apstākļos, visos gadījumos sagaidāma apmierinoša augšana, izņemot L. fermentum, kam var būt regulāra raža.

Lai novērtētu barotnes sterilitāti, vienu vai divas katras sagatavotās partijas plāksnes (bez inokulācijas) 24 stundas inkubē 37 ° C temperatūrā aerobos. Pēc šī laika barotnē nedrīkst novērot augšanu vai krāsas izmaiņas.

Ierobežojumi

-Neuzkausējiet agaru vairāk kā vienu reizi.

-Sagatavotā barotne var ilgt līdz 3 mēnešiem, kamēr to tur ledusskapī un aizsargā no gaismas.

-Šī barotne nav piemērota prasīgiem vai anaerobiem mikroorganismiem.

Atsauces

1. Valsts zāļu, pārtikas un medicīnas tehnoloģiju pārvalde (ANMAT). Pārtikas mikrobioloģiskā analīze, oficiālā analītiskā metodika, indikatoru mikroorganismi. 2014. gada 3. sējums. Pieejams vietnē: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Cgar Agars. 2009.Pieejams vietnē: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa laboratorijas. Standarta metodes agars (PCA) saskaņā ar APHA un ISO 4833. Pieejams vietnē: condalab.com
4. Britannia laboratorijas. Agara plātņu skaits. 2015.Pieejams vietnē: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B un Velázquez O. 2009. Pārtikas produktu mikrobioloģiskās analīzes paņēmieni. 2. ed. UNAM Ķīmijas fakultāte. Meksika. Pieejams: depa.fquim.unam