REKOMBINANTĀ DNS: TEHNIKA, PIELIETOJUMI UN PAMATI - BIOLOĢIJA - 2025

Rekombinantā DNS (rDNS vai rDNS) ir mākslīga Nukleīnskābes molekula, kas izveidots laboratorijā, integrējot divus segmentus procentu organizācijām. Pateicoties hibrīda īpašībai, to sauc arī par kimēru DNS. Šāda veida DNS dabā nav atrodams.

Pamatmetodika tā ģenerēšanai ietver: (a) mērķa DNS atlasi un ievietošanu citā DNS fragmentā (parasti baktēriju plazmīdā); (b) šīs plazmidijas ievadīšana baktērijā, c) baktēriju atlase ar antibiotiku palīdzību un, visbeidzot, (d) gēna ekspresija.

Avots: pixabay.com

Metode izmanto fermentu kopumu, kas ļauj kopēt un ielīmēt noteiktus DNS fragmentus saskaņā ar pētnieka lēmumu.

Rekombinantās tehnoloģijas mērķis vairumā gadījumu ir olbaltumvielu (pazīstamas kā rekombinantās olbaltumvielas) ekspresija, ko vēlas molekulārais biologs turpmākiem pētījumiem vai lai izveidotu olbaltumvielu ar komerciālu un terapeitisku vērtību - piemēram, cilvēka insulīns, piemēram.

Rekombinantās DNS tehnikas pamati un izmantošana gēnu inženierijā

Molekulārās bioloģijas centrālā dogma

Visām organiskajām būtnēm, kuras mēs zinām, ir vairākas īpašības. Viens no tiem ir ģenētiskā materiāla raksturs un olbaltumvielu pagatavošanas process - process, kas pazīstams kā molekulārās bioloģijas centrālā “dogma”.

Visi organismi, izņemot pāris vīrusus, glabā ģenētisko informāciju DNS (dezoksiribonukleīnskābē), kas ļoti kompakti un organizēti tiek savākta šūnas kodolā.

Gēnu ekspresijai DNS molekula tiek transkribēta Messenger RNS, un pēdējā tiek tulkota aminoskābju, olbaltumvielu veidojošo elementu, valodā.

Kas ir rekombinantā DNS?

Laika posmā no 70. līdz 1980. gadiem molekulārie biologi sāka izmantot procesus, kas dabiski notiek šūnas iekšienē, un spēja tos ekstrapolēt laboratorijā.

Tādējādi baktērijas DNS segmentā varētu ievietot dzīvnieku izcelsmes gēnu (piemēram, mugurkaulnieku); vai baktērijas DNS var apvienot ar vīrusu DNS. Tādējādi mēs varam definēt rekombinanto DNS kā molekulu, kas sastāv no divu dažādu organismu DNS.

Kad šī hibrīda vai rekombinantā molekula ir izveidota, interesējošais gēns tiek izteikts. Ar vārdu izteicienu mēs vēlamies atsaukties uz olbaltumvielu tulkošanas procesu.

Restrikcijas enzīmi un ligas: procesa atslēga

Galvenais elements rekombinantās DNS tehnoloģijas attīstībā bija restrikcijas enzīmu atklāšana.

Tās ir olbaltumvielu molekulas, kurām piemīt spēja sašķelt DNS (nukleāzes) īpašās sekvencēs, kalpojot par “molekulārajām šķērēm”. Šo enzīmu radītie fragmenti tiek saukti par restrikcijas fragmentiem.

Minētie fermenti var radīt simetriskus griezumus mērķa secībā (abās ķēdēs vienā augstumā) vai asimetriskus griezumus. Galvenais restrikcijas enzīmu darbības aspekts ir tas, ka pēc ķēžu šķelšanās tiek iegūta "vaļīga mala", kas papildina otru malu, kuru sagriež tas pats ferments.

Daži piemēri ir ECOR 1 un Sma 1. Pašlaik ir zināmi un komerciāli pieejami vairāk nekā 200 restrikcijas enzīmu veidi.

Lai šķēres būtu noderīgas, tām jāpievieno līme. Šo DNS (iepriekš apstrādāta ar restrikcijas fermentiem) noslēgšanas darbību veic ar līzēm.

Metode: kā laboratorijā mākslīgi tiek modificēts organisma DNS?

Zemāk mēs aprakstīsim galvenos soļus, kas nepieciešami rekombinantās DNS tehnoloģijai. Tos visus veic profesionāļi molekulārās bioloģijas laboratorijā.

Kas ir "klons"?

Pirms turpināt eksperimenta protokolu, mums jāņem vērā, ka molekulārajā bioloģijā un biotehnoloģijā tiek plaši izmantoti termini "klons" un darbības vārds "klons". Tas varētu radīt neskaidrības.

Šajā kontekstā mēs nenozīmējam visa organisma klonēšanu (kā, piemēram, slavenās aitas Dolly gadījumā), bet gan DNS gabala, kas var būt gēns, klonēšanu. Tas ir, ražojot daudzas secības ģenētiski identiskas kopijas.

1. DNS izolēšana un iegūšana

Pirmais solis ir izlemt, kuru secību vēlaties izmantot. Tas pilnībā ir atkarīgs no pētnieka un viņa darba mērķiem. Pēc tam šī DNS ir jāizolē un jāattīra. Metodes un procedūras, lai to panāktu, savukārt ir atkarīgas no ķermeņa un audiem.

Parasti ņem audu gabalu un apstrādā lizēšanas buferī ar proteināzi K (proteolītisko enzīmu), un pēc tam DNS ekstrahē. Pēc tam ģenētiskais materiāls tiek sadalīts mazos fragmentos.

2. Klonēšanas vektors

Pēc sagatavošanās posmiem pētnieks cenšas klonēšanas vektorā ieviest interesējošo DNS segmentu. Turpmāk mēs sauksim šo DNS segmentu par balto DNS.

Plazmīdas

Viens no baktēriju izcelsmes plazmidā visvairāk izmantotajiem vektoriem. Plazmīda ir divkārša, apaļa DNS molekula, kas dabiski atrodama baktērijās. Tie ir sveši baktēriju hromosomā - tas ir, tie ir ekstrahromosomāli, un dabiski atrodami šajos prokariotos.

Vektora pamatelementi ir: (a) replikācijas sākums, kas ļauj DNS sintēzei; b) atlases aģents, kas ļauj identificēt organismus, kas nes plazmidi ar mērķa DNS, piemēram, rezistenci pret kādu antibiotiku; un (c) multiklonēšanas vieta, kur atrodamas sekvences, kuras atpazīs restrikcijas enzīmi.

Pirmā veiksmīgā rekombinantā DNS laboratorijā tika klonēta pSC101 plazmidā no baktērijas E. coli. Papildus replikācijas sākumam tas satur arī restrikcijas enzīma EcoRI un gēna rezistenci pret antibiotikām.

Mērķa DNS ievietošana plazmidā tiek veikta, izmantojot iepriekšējā sadaļā aprakstītos restrikcijas enzīmu un ligas molekulāros instrumentus.

Atlikušie vektoru veidi

Papildus plazmīdām DNS var ievietot arī citos vektoros, piemēram, bakteriofāga lambdā, kosmīdos, YAC (rauga mākslīgās hromosomas), BAC (baktēriju mākslīgās hromosomas) un fagemīdos.

3. Rekombinantās DNS ievadīšana

Kad ir iegūta rekombinantā DNS molekula (gēns, kas interesē plazmīdu vai citu vektoru), to ievada saimniekorganismā vai saimnieka organismā, kas var būt baktērija.

Lai ievadītu baktērijas svešā DNS, tiek izmantota metode, ko sauc par baktēriju pārveidošanu, kur organismu apstrādā ar divvērtīgiem katjoniem, kas padara to jutīgu pret DNS uzņemšanu.

Metodoloģiski mēs nevaram garantēt, ka 100% baktēriju mūsu kultūrā ir efektīvi pārņēmuši mūsu rekombinantās DNS molekulu. Šeit nonāk plazmidijas daļa, kas satur rezistenci pret antibiotikām.

Tādējādi baktērijas, kuras ir pārņēmušas plazmīdu, būs izturīgas pret noteiktu antibiotiku. Lai tos izvēlētos, pietiks ar minēto antibiotiku uzklāšanu un izdzīvojušo uzņemšanu.

4. Olbaltumvielu "novākt"

Pēc baktēriju atlases ar mūsu rekombinanto DNS mēs sākam izmantot saimnieka fermentatīvo mehānismu, lai radītu interesējošo olbaltumvielu produktu. Baktērijām reproducējot, plazmīda tiek nodota viņu pēcnācējiem, tāpēc sadalīšanas laikā tā netiek zaudēta.

Šajā procedūrā baktērijas tiek izmantotas kā sava veida olbaltumvielu "rūpnīca". Vēlāk redzēsim, ka tā ir bijusi ļoti būtiska procedūra efektīvu ārstniecības līdzekļu izstrādē.

Kad kultūra ir gatava un baktērijas ir saražojušas daudz olbaltumvielu, šūna tiek lizēta vai izjaukta. Pastāv plašs bioķīmisko paņēmienu klāsts, kas ļauj proteīnus attīrīt pēc to fizikāli ķīmiskajām īpašībām.

Citā eksperimentālā kontekstā mēs, iespējams, neesam ieinteresēti olbaltumvielu ģenerēšanā, bet drīzāk esam ieinteresēti iegūt DNS secību per se. Ja tas tā būtu, plazmīdu izmantotu, lai izveidotu vairākas interesējošā fragmenta kopijas, lai mērķa DNS būtu pietiekami daudz, lai veiktu attiecīgos eksperimentus.

Lietojumprogrammas

Rekombinantā DNS tehnoloģija pavēra bezgalīgu skaitu iespēju molekulārajā bioloģijā, biotehnoloģijā, medicīnā un citās saistītās jomās. Tās izcilākie pielietojumi ir šādi.

Ģenētiskā analīze

Pirmais pieteikums ir tieši saistīts ar molekulārās bioloģijas laboratorijām. Rekombinantās DNS tehnoloģija ļauj pētniekiem izprast normālu gēnu darbību, un ģenerētos proteīnus var izmantot turpmākajos pētījumos.

Farmaceitiskā rūpniecība

Olbaltumvielas, kas ražotas, izmantojot rekombinantās DNS procedūru, ir pielietojamas medicīnā. Divi ļoti svarīgi piemēri šajā jomā ir cilvēka insulīns un augšanas hormons, ko lieto pacientiem, kuriem trūkst šī proteīna.

Pateicoties rekombinantai DNS, šīs olbaltumvielas var ģenerēt, neradot nepieciešamību tās iegūt no cita cilvēka, kas rada papildu metodoloģiskas komplikācijas un veselības risku. Tas ir palīdzējis uzlabot neskaitāmu pacientu dzīves kvalitāti.

Atsauces

1. Baca, LEL un Álvarez, CLC (2015). Bioloģija 2. Grupo Editorial Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). Šūna: molekulārā pieeja (10. sēj.). Vašingtona, DC: ASM prese.
3. Devlins, TM (2004). Bioķīmija: mācību grāmata ar klīnisko pielietojumu. Es apgriezos.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Rekombinantās DNS tehnoloģijas loma dzīves uzlabošanā. Starptautiskais genomikas žurnāls, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Patoloģiskā anatomija. Elsevier Spānija.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Ievads mikrobioloģijā. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Cilvēka insulīns: DNS tehnoloģijas pirmā narkotika. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.