DNS MIKRORAJONI: PROCEDŪRA UN PIELIETOJUMI - BIOLOĢIJA - 2025

DNS microarray , ko sauc arī DNS čipu vai DNS microarray, veido virkni DNS fragmentu, kas nostiprināts pie fizisko atbalstam mainīgu materiāla, neatkarīgi no tā, plastmasas vai stikla. Katrs DNS gabals apzīmē secību, kas papildina noteiktu gēnu.

Mikrouzņēmumu galvenais mērķis ir noteiktu interesējošo gēnu ekspresijas salīdzinošie pētījumi. Piemēram, parasti šo metodi piemēro diviem paraugiem - vienam veselos apstākļos un otram patoloģiskam -, lai identificētu, kuri gēni tiek izteikti un kuri neatrodas paraugā ar šo stāvokli. Minētais paraugs var būt šūna vai audi.

Autors Paphrag angļu Vikipēdijā (Pārcelts no en.wikipedia uz Commons.), Via Wikimedia Commons

Parasti gēnu ekspresiju var noteikt un kvantitatīvi noteikt, izmantojot fluorescējošas molekulas. Ar mikroshēmām manipulē vairumā gadījumu robots, un vienlaikus var analizēt lielu skaitu gēnu.

Šī jaunā tehnoloģija ir noderīga visdažādākajām disciplīnām, sākot ar medicīnisko diagnostiku un beidzot ar dažādiem molekulārās bioloģijas pētījumiem proteomikas un genomikas jomā.

No kā tas sastāv?

DNS (dezoksiribonukleīnskābes) mikroarhīvi ir īpašu DNS segmentu kopums, kas piestiprināts cietai matricai. Šīs sekvences papildina gēnus, kurus vēlas izpētīt, un uz cm ² var būt līdz 10 000 gēnu .

Šīs īpašības ļauj sistemātiski un apjomīgi izpētīt organisma gēnu ekspresiju.

Informācija, kas šūnai jāfunkcionē, ​​tiek kodēta vienībās, ko sauc par “gēniem”. Dažos gēnos ir norādījumi būtisku bioloģisko molekulu, ko sauc par olbaltumvielām, izveidošanai.

Gēns tiek izteikts, ja tā DNS tiek transkribēta kā starpniekservera RNS molekula, un gēna ekspresija var mainīties atkarībā no šī DNS segmenta transkripcijas līmeņa. Dažos gadījumos izpausmes izmaiņas var liecināt par slimībām.

Hibridizācijas princips padara iespējamu mikroarāmu darbību. DNS ir molekula, ko veido četru veidu nukleotīdi: adenīns, timīns, guanīns un citozīns.

Lai veidotu dubultā spirāles struktūru, adenīna grupas ar timīnu un citozīns ar guanīnu. Tādējādi divas komplementāras ķēdes var savienot ar ūdeņraža saitēm.

Mikrouzņēmumu veidi

Runājot par mikroarhīvu struktūru, ir divas variācijas: individuāli izgatavoti komplementāri DNS vai oligonukleotīdi un komerciāli augsta blīvuma mikroarhīvi, kurus ražo komerciāli uzņēmumi, piemēram, Affymetrix GeneChip.

Pirmā veida mikroarhīvs ļauj analizēt RNS no diviem dažādiem paraugiem vienā mikroshēmā, bet otrais variants ir komerciāls un tajā ir liels gēnu skaits (piemēram, Affymetrix GeneChip ir aptuveni 12 000 cilvēka gēnu), kas ļauj analizēt viens paraugs.

Process

RNS izolācija

Pirmais eksperimenta veikšanas paņēmiens, izmantojot mikrorajona tehnoloģiju, ir RNS molekulu izolēšana un attīrīšana (tā var būt MNS Messenger vai cita veida RNS).

Ja vēlaties salīdzināt divus paraugus (veselīgi, salīdzinot ar slimiem, kontroles un ārstēšanu, cita starpā), molekula jāizolē abos audos.

CDNS ražošana un marķēšana

Pēc tam RNS tiek pakļauts reversās transkripcijas procesam marķētu nukleotīdu klātbūtnē, un tādējādi tiks iegūta komplementārā DNS vai cDNS.

Etiķete var būt fluorescējoša, un tai jābūt atdalāmai starp diviem analizējamiem audiem. Parasti tiek izmantoti fluorescējošie savienojumi Cy3 un Cy5, jo tie izstaro fluorescenci dažādos viļņu garumos. Cy3 gadījumā tā ir krāsa, kas ir tuvu sarkanai, un Cy5 atbilst spektram starp oranžu un dzeltenu.

Hibridizācija

CDNS sajauc un inkubē DNS mikromašīnā, lai no abiem paraugiem varētu hibridizēt (ti, notiek saistīšana) ar DNS daļu, kas imobilizēta uz mikroarmasas cietās virsmas.

Lielāks hibridizācijas procentuālais daudzums ar zondi mikroarhīvā tiek interpretēts kā atbilstošās mRNS augstāka izpausme audos.

Sistēmas nolasīšana

Izteiksmes kvantitatīvo noteikšanu veic, iestrādājot lasītāja sistēmu, kas piešķir krāsu kodu katras cDNS izstarotās fluorescences daudzumam. Piemēram, ja patoloģiskā stāvokļa apzīmēšanai izmanto sarkano krāsu un tā hibridizējas lielākā proporcijā, sarkanā sastāvdaļa būs galvenā.

Izmantojot šo sistēmu, var zināt katra analizētā gēna pārmērīgu ekspresiju vai apspiešanu abos izvēlētajos apstākļos. Citiem vārdiem sakot, eksperimentā novērtēto paraugu transkripts var būt zināms.

Larssono, no Wikimedia Commons

Lietojumprogrammas

Pašlaik mikroarhīvi tiek uzskatīti par ļoti spēcīgiem instrumentiem medicīnas jomā. Šī jaunā tehnoloģija ļauj diagnosticēt slimības un labāk izprast, kā gēnu ekspresija tiek modificēta dažādos medicīniskos apstākļos.

Turklāt tas ļauj salīdzināt kontroles audus un audus, kas apstrādāti ar noteiktu medikamentu, lai izpētītu iespējamās medicīniskās ārstēšanas sekas.

Lai to izdarītu, pirms un pēc zāļu ievadīšanas tiek salīdzināts normāls un slims stāvoklis. Pētot zāļu ietekmi uz genomu in vivo, mums ir labāks pārskats par tā darbības mehānismu. Var arī saprast, kāpēc dažas konkrētas zāles rada nevēlamas blakusparādības.

Vēzis

Vēzis ir to slimību saraksta augšgalā, kuras pētītas ar DNS mikroarāmu palīdzību. Šī metodika ir izmantota slimības klasifikācijai un prognozēšanai, īpaši leikēmiju gadījumos.

Šī stāvokļa izpētes lauks ietver vēža šūnu molekulāro bāzu saspiešanu un raksturošanu, lai atrastu gēnu ekspresijas modeļus, kuru rezultātā rodas neveiksmes šūnu cikla regulēšanā un šūnu nāves (vai apoptozes) procesos.

Citas slimības

Izmantojot mikrogrāfus, ir bijis iespējams noskaidrot gēnu diferenciālās ekspresijas profilus alerģiju, primāro imūndeficītu, autoimūno slimību (piemēram, reimatoīdā artrīta) un infekcijas slimību medicīniskos apstākļos.

Atsauces

1. Bednārs, M. (2000). DNS mikroarhīva tehnoloģija un pielietojums. Medicīnas zinātnes monitors, 6 (4), MT796-MT800.
2. Kurella, M., Hsiao, LL, Yoshida, T., Randall, JD, Chow, G., Sarang, SS,… & Gullans, SR (2001). Sarežģītu bioloģisko procesu DNS mikroarhīva analīze. Amerikas Nefroloģijas biedrības žurnāls, 12 (5), 1072-1078.
3. Nguyen, DV, Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, RJ (2002). DNS mikrorajona eksperimenti: bioloģiskie un tehnoloģiskie aspekti. Biometrija, 58 (4), 701–717.
4. Plouss, CV (2007). DNS mikrorajoni un to pielietojums biomedicīnas pētījumos. CENIC žurnāls. Bioloģiskās zinātnes, 38 (2), 132-135.
5. Wiltgen, M., & Tilz, GP (2007). DNS mikrorajona analīze: principi un klīniskā ietekme. Hematoloģija, 12 (4), 271–287.