RESTRIKCIJAS ENZĪMI: FUNKCIJAS, VEIDI UN PIEMĒRI - BIOLOĢIJA - 2025

Par restrikcijas fermenti ir endonucleases nodarbina noteiktu Arheji un baktērijām, lai kavētu vai "ierobežo" izplatību vīrusu iekšā. Tie ir īpaši izplatīti baktērijās un ir daļa no viņu aizsardzības sistēmas pret svešām DNS, kas pazīstama kā ierobežošanas / modifikācijas sistēma.

Šie fermenti katalizē divjoslu DNS šķelšanos noteiktās vietās reproducējami un neizmantojot papildu enerģiju. Lielākajai daļai nepieciešama tādu kofaktoru klātbūtne kā magnijs vai citi divvērtīgi katjoni, lai gan dažiem ir vajadzīgs arī ATP vai S-adenozilmetionīns.

HindIII restrikcijas enzīmu reakcijas shēma (Avots: Helixitta caur Wikimedia Commons)

Restrikcijas endonukleāzes 1978. gadā atklāja Daniels Natans, Ārberts Verners un Hamiltons Smits, kuri par atklājumu saņēma Nobela prēmiju medicīnā. Viņu vārds parasti cēlies no organisma, kur tie pirmo reizi novēroti.

Šādus fermentus plaši izmanto DNS klonēšanas metožu un citu molekulārās bioloģijas un gēnu inženierijas stratēģiju izstrādē. Viņu īpašās sekvences atpazīšanas īpašības un spēja sagriezt sekvences tuvu atpazīšanas vietām padara tos par spēcīgiem instrumentiem ģenētiskajā eksperimentā.

Fragmentus, ko rada restrikcijas enzīmi, kuri ir iedarbojušies uz noteiktu DNS molekulu, var izmantot, lai atjaunotu sākotnējās molekulas "karti", izmantojot informāciju par vietām, kur enzīms sagriež DNS.

Dažiem restrikcijas fermentiem var būt tāda pati atpazīšanas vieta uz DNS, taču tie ne vienmēr to sadala vienādi. Tādējādi ir fermenti, kas sagriež atstājot neass galus, un fermenti, kas sagriež atstājot saliektos galus, kuriem molekulārajā bioloģijā ir dažādi pielietojumi.

Pašlaik ir simtiem dažādu komerciāli pieejamu ierobežošanas enzīmu, kurus piedāvā dažādas komerciālas mājas; Šie fermenti funkcionē kā "pielāgotas" molekulu šķēres dažādiem mērķiem.

Iespējas

Restrikcijas fermenti pilda pretējo polimerāžu funkciju, jo tie hidrolizē vai sašķeļ estera saiti fosfodiestera saitē starp blakus esošajiem nukleotīdiem nukleotīdu ķēdē.

Molekulārajā bioloģijā un gēnu inženierijā tos plaši izmanto ekspresijas un klonēšanas vektoru konstruēšanai, kā arī specifisku secību identificēšanai. Tie ir noderīgi arī rekombinanto genomu veidošanā, un tiem ir liels biotehnoloģiskais potenciāls.

Nesenie sasniegumi gēnu terapijā pašreiz izmanto restrikcijas enzīmus, lai ieviestu noteiktus gēnus vektoros, kas ir nesēji šādu gēnu transportēšanai dzīvās šūnās un kuriem, iespējams, ir spēja ievietot šūnu genomā, lai veiktu pastāvīgas izmaiņas.

Darbības mehānisms

Restrikcijas fermenti var katalizēt divjoslu DNS šķelšanos, kaut arī daži spēj atpazīt vienas joslas DNS sekvences un pat RNS. Griešana notiek pēc secību atpazīšanas.

Darbības mehānisms sastāv no fosfodiestera saites hidrolīzes starp fosfātu grupu un dezoksiribozi katras DNS virknes skeletā. Daudzi fermenti spēj sagriezt tajā pašā vietā, ko viņi atpazīst, savukārt citi sagriež starp 5 un 9 bāzes pāriem pirms vai pēc tā.

Parasti šie fermenti sagriež fosfātu grupas 5 'galā, veidojot DNS fragmentus ar 5' fosforila galu un 3 'galu hidroksilgalu.

Tā kā olbaltumvielas nav tiešā saskarē ar atpazīšanas vietu DNS, tās jāpārvieto secīgi, līdz tiek sasniegta konkrētā vieta, iespējams, izmantojot "slīdēšanas" mehānismus uz DNS virknes.

Fermentatīvas šķelšanās laikā katras DNS virknes fosfodiestera saite atrodas vienā no restrikcijas enzīmu aktīvajām vietām. Kad ferments atstāj atpazīšanas un šķelšanās vietu, tas notiek caur nespecifiskām īslaicīgām asociācijām.

Veidi

Pašlaik ir zināmi pieci restrikcijas enzīmu veidi. Šeit ir īss katra no tām apraksts:

I tipa restrikcijas enzīmi

Šie fermenti ir lieli pentameric proteīni ar trim apakšvienībām, viens restrikcijai, viens metilēšanai un otrs sekvences atpazīšanai DNS. Šīs endonukleāzes ir daudzfunkcionālas olbaltumvielas, kas spēj katalizēt restrikcijas un modifikācijas reakcijas, tām ir ATPāzes aktivitāte un arī DNS topoizomerāze.

Šāda veida fermenti bija pirmie atklātie endonukleāzes, tie pirmo reizi tika attīrīti 60. gados un kopš tā laika ir dziļi pētīti.

I tipa fermenti netiek plaši izmantoti kā biotehnoloģisks rīks, jo šķelšanās vieta var atrasties mainīgā attālumā līdz 1000 bāzes pāriem no atpazīšanas vietas, kas padara tos neuzticamus eksperimentālās reproducējamības ziņā.

II tipa restrikcijas enzīmi

Tie ir fermenti, kas sastāv no homodimeriem vai tetrameriem, kas sagriež DNS noteiktās vietās no 4 līdz 8 bp garumā. Šīs šķelšanās vietas parasti ir palindromiskas, tas ir, tās atpazīst sekvences, kuras abos virzienos nolasa vienādi.

Daudzi II tipa restrikcijas fermenti baktērijās sagriež DNS, kad viņi atpazīst tā svešo raksturu, jo tam nav raksturīgu modifikāciju, kādai vajadzētu būt tās pašas DNS.

Šie ir vienkāršākie restrikcijas enzīmi, jo DNS secību atpazīšanai un sagriešanai nav vajadzīgs cits kofaktors, izņemot magniju (Mg +).

II tipa restrikcijas enzīmu precizitāte, identificējot un sagriežot vienkāršas DNS secības precīzās pozīcijās, padara tos par visizplatītākajiem un neaizstājamākajiem vairumā molekulārās bioloģijas nozaru.

II tipa restrikcijas enzīmu grupā ir vairākas apakšklases, kas klasificētas pēc noteiktām īpašībām, kuras ir unikālas katram. Šo fermentu klasifikācija tiek veikta, pievienojot alfabēta burtus no A līdz Z pēc fermenta nosaukuma.

Dažas apakšklases, kas vislabāk pazīstamas ar lietderību, ir:

IIA apakšklase

Tie ir dažādu apakšvienību dimēri. Viņi atpazīst asimetriskas secības un tiek izmantoti kā ideāli prekursori griešanas enzīmu ģenerēšanai.

IIB apakšklase

Tos veido viens vai vairāki dimēri un sagriezti DNS abās atpazīšanas sekvences pusēs. Viņi sagriež abas DNS šķipsnas bāzes pāra intervālā pirms atpazīšanas vietas.

IIC apakšklase

Šāda veida fermenti ir polipeptīdi ar DNS šķiedru dalīšanas un modifikācijas funkcijām. Šie fermenti asimetriski sagriež abus virzienus.

IIE apakšklase

Šīs apakšklases fermenti ir visvairāk izmantoti gēnu inženierijā. Viņiem ir katalītiskā vieta, un tiem parasti ir nepieciešams alosteriskais efektors. Šiem fermentiem ir jābūt mijiedarbībai ar diviem to atpazīšanas secības eksemplāriem, lai veiktu efektīvu šķelšanos. Šajā apakšklasē ir fermenti EcoRII un EcoRI.

III tipa restrikcijas enzīmi

III tipa restrikcijas endonukleāzes sastāv tikai no divām apakšvienībām, viena ir atbildīga par DNS atpazīšanu un modifikāciju, bet otra ir atbildīga par sekvences šķelšanos.

Šiem fermentiem to darbībai nepieciešami divi kofaktori: ATP un magnijs. Šāda veida ierobežojošajiem enzīmiem ir divas asimetriskas atpazīšanas vietas, tie pārvieto ATP atkarīgā veidā DNS un sagriež to starp 20-30 bp blakus atpazīšanas vietai.

IV tipa restrikcijas enzīmi

IV tipa fermentus ir viegli identificēt, jo tie sagriež DNS ar metilēšanas zīmēm, tie sastāv no vairākām dažādām apakšvienībām, kas ir atbildīgas par DNS sekvences atpazīšanu un sagriešanu. Šie fermenti kā kofaktorus izmanto GTP un divvērtīgo magniju.

Specifiskas šķelšanās vietas ietver nukleotīdu virknes ar metilētām vai hidroksimetilētām citozīnu atliekām vienā vai abās nukleīnskābju daļās.

V tipa restrikcijas enzīmi

Šajā klasifikācijā tiek grupēti CRISPER-Cas tipa fermenti, kas identificē un izgriež īpašas DNS sekvences no iebrukušajiem organismiem. Cas fermenti izmanto CRISPER sintezētas virzošās RNS virkni, lai atpazītu un uzbrūk iebrucējiem organismiem.

Fermenti, kas klasificēti kā V tips, ir polipeptīdi, kas strukturēti pēc I, II un II tipa fermentiem. Viņi var izgriezt gandrīz jebkura organisma DNS sekcijas ar plašu garumu. To elastība un ērta lietošana padara šos fermentus par vienu no mūsdienās visplašāk izmantotajiem instrumentiem gēnu inženierijā, kā arī II tipa fermentus.

Piemēri

Restrikcijas fermenti ir izmantoti DNS polimorfismu noteikšanai, īpaši populāciju ģenētiskajos pētījumos un evolūcijas pētījumos, izmantojot mitohondriju DNS, lai iegūtu informāciju par nukleotīdu aizvietošanas ātrumu.

Pašlaik vektoriem, ko izmanto baktēriju pārveidošanai dažādiem mērķiem, ir multiklonēšanas vietas, kur atrodamas atpazīšanas vietas vairākiem restrikcijas fermentiem.

Starp šiem fermentiem vispopulārākie ir EcoRI, II, III, IV un V, kas pirmo reizi iegūti un aprakstīti no E. coli; HindIII no H. influenzae un BamHI no B. amyloliquefaciens.

Atsauces

1. Bickle, TA, & Kruger, DH (1993). DNS ierobežošanas bioloģija. Mikrobioloģisko pētījumu pārskats, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR nodrošina iegūto rezistenci pret vīrusiem prokariotos. Zinātne, 315 (marts), 1709. – 1713.
3. Goodsell, D. (2002). Molekulārā perspektīva: Restrikcijas endonukleāzes. Cilmes šūnu vēža medicīnas pamati, 20., 190. – 191.
4. Halfords, SE (2001). Pārlēkšana, lekt un cilpa ar restrikcijas fermentiem. Bioķīmiskās sabiedrības darījumi, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Sugu identitātes uzturēšana un baktēriju specifikācijas kontrole: vai jauna funkcija ierobežošanas / modifikācijas sistēmām? Gēns, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Ļevina ģenēze XII (12. izdevums). Burlingtons, Masačūsetsa: Džounsa un Bartletas mācīšanās.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… Viņa, Q. (2015). I un III tipa CRISPR-Cas sistēmu izmantošana genoma rediģēšanai. Nukleīnskābju izpēte, 1. – 12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA un Wilson, GG (2013). I tipa restrikcijas enzīmi un to radinieki. Nukleīnskābju izpēte, 1. – 25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restrikcijas endonukleāzes DNS molekulu analīzē un pārstrukturēšanā. Annu. Rev. Biochem. , 273–293.
10. Nei, M., & Tajima, F. (1981). Dna polimorfisms, kas nosakāms ar restrikcijas endonukleāzēm. Ģenētika, 145.-163.
11. Pingouds, A., Fuksīters, M., Pingouds, V., & Wende, W. (2005). Šūnu un molekulārās dzīves zinātnes II tipa restrikcijas endonukleāzes: uzbūve un mehānisms. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Kā restrikcijas enzīmi kļuva par molekulārās bioloģijas darba zirgiem. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ, un Murray, K. (1976). Restrikcijas endonukleāzes. Kritiskās atsauksmes bioķīmijā (novembris), 123.-164.
14. Stoddard, BL (2005). Vietējošās endonukleāzes struktūra un funkcija. Biofizikas ceturkšņa pārskati, 1. – 47.
15. Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Ierobežojumu un ierobežojumu bioloģija. Pašreizējais atzinums mikrobioloģijā, 8, 466. – 472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Vilsons, G. G. un Murray, NE (1991). Ierobežojumu un modifikācijas sistēmas. Annu. Ģen. , 25, 585-627.
17. Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomiskie ieskati Campylobacter jejuni virulencē un populācijas ģenētikā. Infec. Dis. Transl. Med., 2 (3), 109. – 119.
18. Yuan, R. (1981). Daudzfunkciju ierobežojošo endonukleāžu uzbūve un mehānisms. Annu. Rev. Biochem. , 50, 285-315.