ZIEHL-NEELSEN TRAIPS: PAMATOJUMS, REAĢENTI UN TEHNIKA - BIOLOĢIJA - 2025

Ziehl-Neelsen krāsviela paņēmiens, lai identificētu mikroorganismiem izturīgu alkohola skābi (ARA). Šīs mikrobioloģijas procedūras nosaukums attiecas uz tās autoriem: bakteriologu Franzu Zīlu un patologu Frīdrihu Neelsenu.

Šis paņēmiens ir diferencētas krāsošanas veids, kas nozīmē dažādu krāsvielu izmantošanu, lai radītu kontrastu starp struktūrām, kuras vēlaties novērot, atšķirt un vēlāk identificēt. Ziehl-Neelsen traipu izmanto noteiktu mikroorganismu veidu identificēšanai.

Cīla-Neelsena traips

Daži no šiem organismiem ir mikobaktērijas (piemēram, Mycobacterium tuberculosis), nokardija (piemēram, Nocardia sp.) Un daži vienšūnu parazīti (piemēram, Cryptosporidium parvum). Daudzas baktērijas var klasificēt, izmantojot kopēju paņēmienu, ko sauc par Gram traipu.

Tomēr dažām baktēriju grupām ir vajadzīgas citas metodes, lai tās varētu identificēt. Tādām metodēm kā Ziehl-Neelsen traips ir vajadzīgas krāsvielu un siltuma kombinācijas, lai tās piestiprinātu pie šūnas sienas.

Pēc tam notiek balināšanas process, kas ļauj sasniegt divus rezultātus: izturību vai jutību pret skābju un spirtu krāsas maiņu.

Pamats

Šīs krāsošanas tehnikas pamatojums ir balstīts uz šo mikroorganismu šūnu sienas īpašībām. Sienu veido taukskābju tips, ko sauc par molskābes; Tām ir raksturīgas ļoti garas ķēdes.

Ja taukskābēm ir ļoti gara struktūra, tās vieglāk saglabā krāsas. Dažām baktēriju ģintīm ir ļoti grūti notraipīt Gram traipus, jo šūnas sienā ir augsts mikoolskābju saturs.

Ziehl-Neelsen traipā tiek izmantots fenola savienojums karbola fuksīns, pamata traips. Tam piemīt spēja mijiedarboties ar šūnas sienas taukskābēm, kuras istabas temperatūrā ir vaskotas struktūras.

Karbola fuksīna krāsošana tiek pastiprināta siltuma klātbūtnē, jo vasks kūst un krāsas molekulas ātrāk pārvietojas šūnas sienā.

Vēlāk izmantotā skābe kalpo to krāsu izbalēšanai, kuras nebija iekrāsotas, jo to siena nebija pietiekami saistīta ar krāsvielu; tāpēc skābes balinātāja stiprums spēj noņemt skābes krāsvielu. Šūnas, kas pretojas šai krāsas maiņai, sauc par ātri skābēm.

Sekundārais krāsviela

Pēc parauga atkrāsošanas to kontrastē ar citu krāsu, ko sauc par sekundāro krāsvielu. Parasti izmanto metilēnzilo vai malahīta zaļo.

Sekundārā krāsa krāso fona materiālu un tādējādi rada kontrastu ar struktūrām, kuras tika iekrāsotas pirmajā solī. Tikai krāsas mainījušās šūnas absorbē otro krāsvielu (zemkrāsu) un iegūst krāsu, bet skābes noturīgās šūnas saglabā sarkano krāsu.

Šo procedūru bieži izmanto, lai identificētu Mycobacterium tuberculosis un Mycobacterium leprae, ko sauc par skābi izturīgām baktērijām.

Reaģenti

Primārais krāsviela

Tiek izmantots 0,3% karbola fuksīns (filtrēts). Šo krāsvielu sagatavo no spirtu maisījuma: fenola etanolā (90%) vai metanola (95%), un šajā maisījumā izšķīdina 3 gramus pamata fuksīna.

Balināšanas šķīdums

Šajā posmā var izmantot 3% spirtskābes vai 25% sērskābes šķīdumus.

Sekundārā krāsa (pretkrāsa)

Paraugu kontrastēšanai visbiežāk izmantotā krāsviela ir 0,3% metilēnzilā. Tomēr var izmantot arī citus, piemēram, 0,5% malahīta zaļo.

Tehnika

Krāsošana ar skābi ātri

Sagatavo baktēriju uztriepi

Šo sagatavošanu veic uz tīra, sausa priekšmetstikliņa, ievērojot sterilitātes piesardzības pasākumus.

Uztriepes žāvēšana

Ļauj uztriepei nožūt istabas temperatūrā.

Uzkarsē paraugu

Paraugs jāuzsilda, uzliekot uguni zemākajam priekšmetstikliņam. Fiksēšanu ar spirtu var veikt, ja uztriepe nav sagatavota ar krēpu (apstrādāta ar nātrija hipohlorītu, lai to balinātu) un ja tā nav paredzēta traipiem tūlīt.

M. tuberculosis tiek noņemts ar balinātāju un krāsošanas procesa laikā. Neapstrādātu krēpu termiskā fiksācija nenogalinās M. tuberculosis, savukārt spirta fiksācija ir baktericīda.

Nosedz traipu

Traipu pārklāj ar karbola fuksīna šķīdumu (primāro pamata traipu).

Sildiet traipu

Tas tiek darīts 5 minūtes. Jums vajadzētu pamanīt tvaika attīstību (aptuveni 60 ° C). Ir svarīgi nepārkarst un izvairīties no parauga sadedzināšanas.

Attiecībā uz traipa apsildīšanu ļoti uzmanīgi jāuzsilda karbola fuksīns, it īpaši, ja krāsošanu veic uz paplātes vai cita trauka, kurā ir savākti viegli uzliesmojoši ķīmiskie materiāli no iepriekšējā krāsojuma.

Zem priekšmetstikliņiem jāuzliek tikai neliela liesma, izmantojot iepriekš apgaismotu tamponu, kas samitrināts ar dažiem pilieniem skāba spirta, metanola vai 70% etanola. Neizmantojiet lielu etanolā samērcētu tamponu, jo tas ir ugunsbīstams.

Nomazgājiet traipu

Šī mazgāšana jāveic ar tīru ūdeni. Ja krāna ūdens nav tīrs, mazgājiet uztriepi ar filtrētu vai destilētu ūdeni, vēlams.

Pārklājiet uztriepi ar skābu spirtu

Šim skābajam spirtam jābūt 3%. Pārklāšanu veic 5 minūtes vai līdz brīdim, kad uztriepe ir pietiekami mainījusies, t.i., gaiši rozā krāsā.

Jāņem vērā, ka skābais spirts ir viegli uzliesmojošs; tāpēc tas jālieto ļoti uzmanīgi. Izvairieties atrasties tuvu aizdegšanās avotiem.

Nomazgājiet traipu

Mazgāšanai vajadzētu būt ar tīru, destilētu ūdeni.

Nosedz uztriepi ar traipu

Tas var būt malahīta zaļš (0,5%) vai metilēnzilais (0,3%) traips no 1 līdz 2 minūtēm, izmantojot ilgāku laiku, ja uztriepes ir plānas.

Nomazgājiet traipu

Atkal jālieto tīrs (destilēts) ūdens.

Lai notek

Slaida aizmugure ir jānotīra un traipu jānovieto uz kanalizācijas statīva, lai tas varētu nožūt (neizmantojiet absorbējošu papīru žāvēšanai).

Pārbaudiet uztriepi zem mikroskopa

Jāizmanto objektīvs 100X un iegremdēšanas eļļa. Sistemātiski skenē uztriepi un reģistrē attiecīgos novērojumus.

Interpretējiet rezultātus

Teorētiski mikroorganismi, kas iekrāso sarkanīgu krāsu, tiek uzskatīti par skābes ātri pozitīviem (AAR +).

Tieši pretēji, ja mikroorganismi iekrāsojas zilā vai zaļā krāsā, atkarībā no krāsvielas, ko izmanto kā pretkrāsu, tos uzskata par skābes ātri negatīviem (AAR-).

Atsauces

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Praktiskās mikrobioloģijas pamati (1. izdevums). Jaypee Brothers medicīnas izdevēji.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobioloģija ar ķermeņa sistēmas slimībām (4. izdevums). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Ievada mikrobioloģija (1. izdevums). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratorijas rokasgrāmata un darba grāmata mikrobioloģijā: lietojumi pacientu aprūpē (11. izdevums). McGraw-Hill izglītība.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Mikrobioloģijas mācību grāmata (1. izdevums). BI publikācijas PVT.