GIEMSA TRAIPS: PAMATOJUMS, MATERIĀLI, TEHNIKA UN PIELIETOJUMS - BIOLOĢIJA - 2025

Giemsa traips ir jebkādas krāsvielas klīniskos paraugus, pamatojoties uz maisījuma skābes un bāzes krāsvielas tips. Tās izveidošanu iedvesmoja Romānovska paveiktais darbs, kurā ķīmiķis un bakteriologs Gustavs Giemsa, kurš sākotnēji bija no Vācijas, to pilnveidoja, pievienojot glicerīnu savienojumu stabilizēšanai.

Izmaiņas, kas radušās oriģinālajā Romanovska tehnikā, ļāva ievērojami uzlabot mikroskopiskos novērojumus, tāpēc šī tehnika tika kristīta ar Giemsa traipu nosaukumu.

Dažādi paraugi iekrāsoti ar Giemsa traipu. A. Trypanosoma evansi perifērajās asinīs. B. Normālas asins šūnas. C. Borrelia theileri perifērajās asinīs. D. Burkita limfoma.

Tā kā tā ir vienkārša veikšanas metode, ļoti funkcionāla un ekonomiska, to pašlaik plaši izmanto hematoloģisko uztriepi, kaulu smadzeņu paraugu un audu sekciju klīniskajā laboratorijā.

Giemsa krāsošanas tehnika ir ļoti noderīga citoloģiskos pētījumos, jo tā ļauj novērot specifiskas šūnu struktūras. Šis paņēmiens krāso šūnu citoplazmas, kodolus, nukleolus, vakuolus un granulas, spējot atšķirt pat smalkas hromatīna pēdas.

Turklāt var atklāt būtiskas izmaiņas kodola lielumā, formā vai krāsā, kur ir iespējams iztēloties kodola un citoplazmas attiecības zudumu.

No otras puses, tas ļauj identificēt nenobriedušas šūnas kaulu smadzenēs un perifērajās asinīs, kas ir svarīgas nopietnu slimību, piemēram, leikēmijas, diagnosticēšanai. Cita starpā ir iespējams noteikt arī hemoparazītus, ekstra un starpšūnu baktērijas, sēnītes.

Citoģenētikā to plaši izmanto, jo ir iespējams izpētīt šūnu mitozi.

Giemsa krāsošanas pamats

Romanovska tipa krāsvielu pamatā ir skābu un bāzisku krāsu kontrasta izmantošana, lai attiecīgi krāsotu pamata un skābes struktūras. Kā redzams, ir skābās krāsas afinitāte uz pamata struktūru traipiem un otrādi.

Pamata krāsviela ir metilēnzilā un tās oksidētie atvasinājumi (debeszils A un debeszils B), bet skābā krāsviela ir eozīns.

Šūnu skābās struktūras ir nukleīnskābes, segmentētu bazofilu granulas, cita starpā, tāpēc tās iekrāsos ar metilēnzilo.

Tādā pašā nozīmē šūnu pamata struktūras ir hemoglobīns un dažas granulas, piemēram, tās, kuras satur segmentēti eozinofīli, cita starpā; tie tiks iekrāsoti ar eozīnu.

No otras puses, tā kā metilēnzilo un debeszilu raksturo metakromatiskās krāsvielas, tās var nodrošināt mainīgu nokrāsu dažādām struktūrām atbilstoši to rīcībā esošo polianjonu slodzei.

Tādējādi stratēģiskajai pamata un skābās krāsvielas kombinācijai izdodas izveidot plašu krāsu spektru atbilstoši katras struktūras bioķīmiskajām īpašībām, skābju struktūras gadījumā iziet cauri gaiši zilām, tumši zilām, ceriņām un purpursarkanām nokrāsām.

Kaut arī eozīna nodrošinātais krāsojums ir stabilāks, tas rada krāsas starp sarkanīgi oranžu un lašu.

materiāli

Materiāli izejas šķīduma pagatavošanai

Pamatšķīduma pagatavošanai ir nepieciešams nosvērt 600 mg pulverveida Giemsa traipu, izmērot 500 cc metilspirta bez acetona un 50 cc neitrāla glicerīna.

Kā sagatavot izejas šķīdumu

Ievietojiet smago Giemsa pulveri javā. Ja ir gabaliņi, tos vajadzētu izsmidzināt. Pēc tam pievienojiet ievērojamu daudzumu izmērītā glicerīna un ļoti labi samaisiet. Iegūto maisījumu ielej ļoti tīrā dzintara pudelē.

Pārējo glicerīnu ievieto javā. Vēlreiz samaisiet, lai notīrītu atlikušo krāsvielu, kas pielipusi pie javas sienām, un ielejiet tajā pašā burkā.

Pudele ir noslēgta un 2 stundas tiek ievietota ūdens vannā 55 ° C temperatūrā. Kamēr tas atrodas ūdens vannā, apmēram ik pēc pusstundas maigi sakratiet maisījumu.

Pēc tam maisījumam ļauj atdzist, lai ievietotu spirtu. Iepriekš daļu izmērītā spirta ievieto javā, lai pabeigtu atlikušā krāsvielas mazgāšanu, un pēc tam to pievieno maisījumam kopā ar pārējo spirtu.

Šim preparātam jāatstāj nogatavoties vismaz 2 nedēļas. Izlietotā rezerves šķīduma daļa jāfiltrē.

Lai izvairītos no preparāta piesārņošanas, ieteicams pastāvīgās lietošanas porciju pārnest uz nelielu dzintara pudelīti ar pilinātāju. Katru reizi uzpildiet reaģentu.

Materiāli buferšķīduma pagatavošanai

No otras puses, buferšķīdumu ar pH 7,2 sagatavo šādi:

6,77 g bezūdens nātrija fosfāta (NaHPO ₄ ), 2,59 g kālija dihidrogēnfosfāta (KH ₂ PO ₄ ) un destilēta ūdens nosver līdz 1000 cm3.

Krāsvielas galīgā sagatavošana

Galīgā krāsošanas šķīduma pagatavošanai mēra 2 ml filtrēta pamatšķīduma un sajauc ar 6 ml buferšķīduma. Maisiet maisījumu.

Svarīgs fakts, kas jāņem vērā, ir tas, ka krāsošanas sagatavošanas paņēmieni var mainīties atkarībā no tirdzniecības uzņēmuma.

Krāsošanas veikšanai nepieciešami papildu materiāli

Bez aprakstītajiem materiāliem, jums ir jābūt krāsojamiem tiltiem, t-krekliem ar ūdeni vai buferšķīdumu mazgāšanai, priekšmetu priekšmetstikliņiem vai pārsegiem, hronometram, lai kontrolētu krāsošanas laiku, blotēšanas papīram vai kādam citam materiālam, ko var izmantot žāvēšanai ( marle vai kokvilna).

Tehnika

Krāsošanas process

1) Pirms krāsošanas parauga uztriepei jābūt gatavai uz tīra priekšmetstikla.

Paraugi var būt asins, kaulu smadzeņu, histoloģisko audu sekcijas vai dzemdes kakla un maksts paraugi. Pirms krāsošanas ieteicams, lai izklājums būtu plāns un 1 vai 2 stundas žāvēts.

2) Uz krāsojamā tilta novietojiet visas krāsas lapas. Jūs vienmēr strādājat vienā secībā, un katra lapa ir labi identificēta.

3) Ievietojiet dažus pilienus 100% metilspirta (metanola) uz uztriepes un ļauj tam iedarboties 3 līdz 5 minūtes, lai paraugs tiktu fiksēts un dehidrēts.

4) Izmetiet uz lapas esošo metanolu un ļaujiet nožūt.

5) Pēc žāvēšanas galīgo krāsošanas šķīdumu ievieto ar pilinātāju, līdz visa lapa ir pārklāta. Atstāj iedarboties 15 minūtes. Daži autori iesaka līdz 25 minūtēm. Tas ir atkarīgs no biznesa mājas.

6) Iztukšojiet traipu un mazgājiet uztriepi ar destilētu ūdeni vai ar 7,2 buferšķīdumu.

7) Ļaujiet lapām uz pūšanas papīra nožūt brīvā dabā, vertikāli izkārtotas ar balsta palīdzību.

8) Notīriet priekšmetstikla aizmuguri ar spirta vai vates tamponu, lai notīrītu traipu pēdas.

Komunālie pakalpojumi

Giemsa krāsošanas paņēmienu izmanto dažādās jomās, tai skaitā: hematoloģijā, mikoloģijā, bakterioloģijā, parazitoloģijā, citoloģijā un citoģenētikā.

Hematoloģija

Tas ir visbiežāk lietotais traips. Ar to var identificēt katru no šūnām, kas atrodas kaulu smadzenēs vai perifēro asiņu paraugos. Kā arī novērtēt katras sērijas skaitu, spēt noteikt leikocitozi vai leikopēniju, trombocitopēniju utt.

Tā kā tas ir jutīgs, lai identificētu nenobriedušas šūnas, tas ir svarīgi akūtas vai hroniskas leikēmijas diagnostikā. Ir iespējams arī diagnosticēt anēmiju, piemēram, sirpjveida šūnu anēmiju, sirpjveida šūnu utt.

Mikoloģija

Šajā jomā tā lietošana ir izplatīta Histoplasma capsulatum (intracelulāras dimorfiskas sēnītes) meklēšanai audu paraugos.

Bakterioloģija

Hematoloģiskās uztriepēs, kas iekrāsotas ar Giemsa, ir iespējams noteikt Borrelias sp pacientiem, kuriem ir slimība, ko sauc par atkārtotu drudzi. Spirochetes ir daudz starp eritrocītiem paraugos, kas ņemti drudža maksimuma laikā.

Inficētās šūnās ir iespējams vizualizēt arī starpšūnu baktērijas, piemēram, Rickettsia sp un Chlamydia trachomatis.

parazitoloģija

Parazitoloģijas jomā Giemsa iekrāsošana ļāva diagnosticēt tādas parazitārās slimības kā malārija, Čagas slimība un leišmanioze.

Pirmajos divos parazītus attiecīgi Plasmodium sp un Trypanosoma cruzi var redzēt inficēto pacientu perifērajās asinīs, tos var atrast dažādos posmos atkarībā no slimības fāzes.

Lai uzlabotu parazītu meklēšanu asinīs, ieteicams lietot Giemsa traipu, kas sajaukts ar maija-Grünwald traipu.

Tāpat ādas leišmaniozi var diagnosticēt, novērtējot Giemsa krāsotus ādas biopsijas paraugus, kur atrodams parazīts.

Citoloģija

Giemsa iekrāsošanu izmanto arī endocervikālo paraugu citoloģiskajiem pētījumiem, lai gan tas nav visbiežāk izmantotais paņēmiens šim mērķim.

Resursu trūkuma gadījumos to var izmantot, ja tai ir līdzīga funkcionalitāte kā tai, ko piedāvā Papanikolaou tehnika, un par zemākām izmaksām. Tomēr tam ir nepieciešama eksaminētāja kompetence.

Citoģenētika

Atbilstoša Giemsa krāsošanas iezīme ir tā spēja stingri saistīties ar adenīna un timīna bagātajiem DNS reģioniem. Tas ļauj vizualizēt DNS šūnu mitozes laikā dažādos kondensācijas stāvokļos.

Šie pētījumi ir nepieciešami, lai noteiktu hromatiskās aberācijas, piemēram, hromosomu dažādu reģionu dublēšanos, dzēšanu vai translokācijas.

Pētījumi, kas pierāda Giemsa traipu efektivitāti

Cannova et al (2016) salīdzināja 3 krāsošanas paņēmienus ādas leišmaniozes diagnozei.

Šim nolūkam viņi izmantoja paraugus, kas iegūti no izmēģinājuma dzīvnieka (Mesocrisetus auratus), kurš eksperimentāli inokulēts ar Leišmanijām.

Autori parādīja, ka Giemsa traips bija labāks par Pap-mart® un Gaffney traipu. Tāpēc viņi uzskatīja Giemsa traipu par ideālu ādas leišmaniozes diagnosticēšanai.

Autoru iegūtie izcilie rezultāti ir saistīti ar faktu, ka krāsvielu kombinācija, kas veido Giemsa maisījumu, rada nepieciešamos apstākļus, lai radītu labvēlīgu kontrastu, ļaujot skaidri atšķirt amastigotu struktūras gan starpšūnu, gan ārpusšūnu starpā.

Arī pārējie paņēmieni (Pap-mart® un Gaffney) to darīja, bet vājākā veidā un tāpēc grūtāk vizualizējami. Tāpēc leišmaniozes parazitoloģiskai diagnostikai ieteicams lietot Giemsa traipu.

Tāpat Ramírez et al (1994) pētījumā tika novērtēts Giemsa un Lendrum traipu derīgums konjunktīvas uztriepēs Chlamydia trachomatis identificēšanai.

Autori noteica, ka Giemsa un Ledrum traipiem ir vienāda specifika, bet tika atzīts, ka Giemsa ir jutīgāki.

Tas izskaidro, kāpēc Giemsa traipus visbiežāk izmanto hlamīdiju infekciju diagnosticēšanai, īpaši, ja ir maz līdzekļu.

Avots: PanReac Applyhem ITW reaģenti. Giemsa traipu. 2. versija: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spānija.

Ieteikumi labai iekrāsošanai

Lokšņu žāvēšanu nevajadzētu paātrināt. Paredzams, ka tas būs pietiekami ilgs laiks, lai to nožūtu brīvā dabā. Aptuveni 2 stundas.

Krāsojiet tūlīt pēc 2 stundām, lai iegūtu labākos rezultātus.

Lai uztriepes labāk nostiprinātos un notraipītu, paraugs uz priekšmetstikliņa jāsadala tā, lai paliek plāns un vienmērīgs slānis.

Vēlamais asins paraugs ir kapilārs, jo uztriepi veido tieši no asiņu piliena un tāpēc paraugā nav nekādu piedevu, kas veicina šūnu struktūru uzturēšanu.

Tomēr, ja tiek izmantotas venozās asinis, EDTA jālieto kā antikoagulants, nevis heparīns, jo heparīns parasti deformē šūnas.

Bieži pieļautās kļūdas Giemsa krāsošanā

Šīs krāsošanas praksē var pieļaut kļūdas. Par tām liecina pēkšņas konstrukciju tonalitātes izmaiņas.

Ļoti zila krāsa

Tas var būt saistīts ar:

• Ļoti biezi uztriepes
• Krāsošanas laika pārsniegšana
• Nepietiekami mazgāt.
• Reaģentu izmantošana krietni virs neitrālā (sārmainā) pH.

Šajos apstākļos tiek izkropļotas šo struktūru krāsas tādā veidā, ka eritrocīti tā vietā, lai iekrāsotu laši rozā, parādīsies zaļi, eozinofilu granulas, kurām jābūt iekrāsotām ķieģeļu sarkanā krāsā, kļūs zilganas vai pelēkas utt. novirze parastajos toņos.

Pārmērīgi rozā krāsā

Tas var būt saistīts ar:

• Nepietiekams krāsošanas laiks.
• Ilgstoša vai pārmērīga mazgāšana.
• Slikta žāvēšana.
• Ļoti skābu reaģentu izmantošana.

Šajā konkrētajā gadījumā struktūras, kas parasti iekrāsojas zilā krāsā, nebūs gandrīz redzamas, savukārt struktūras, kas iekrāso rozā, ar izteikti pārspīlētām nokrāsām.

Piemērs: Eritrocīti kļūs koši sarkani vai izteikti oranži, kodolhromatīns parādīsies gaiši rozā krāsā, un eozinofilu granulas iekrāsosies spilgti sarkanā krāsā.

Nokrišņu klātbūtne uztriepē

Cēloņi var būt šādi:

• Izmantojiet netīras vai slikti mazgātas plēves.
• Neļaujiet uztriepei labi izžūt.
• Atstājot stiprinājuma šķīdumu pārāk ilgi.
• Nepietiekama mazgāšana krāsošanas beigās.
• Nepietiekama izmantotā krāsvielas filtrēšana vai nefiltrēšana.

Morfoloģisko artefaktu klātbūtne

Uztriepes var parādīties morfoloģiski artefakti, kas apgrūtina esošo struktūru vizualizēšanu un interpretēšanu. Tas ir saistīts ar:

• Izmantotā antikoagulanta veids, piemēram, heparīns.
• Netīru, nolietotu vai taukainu plēvju lietošana.

Uzglabāšanas režīms

Pēc sagatavošanas krāsviela jāuztur istabas temperatūrā (15–25 ° C), lai krāsviela neizgulsnētos. Tas jāuzglabā cieši noslēgtā dzintara traukā.

Atsauces

1. Cannova D, Brito E un Simons M. Krāsošanas paņēmienu novērtēšana ādas leišmaniozes diagnozei. Salus. 2016; 20 (2): 24.-29.
2. PanReac Applyhem ITW reaģenti. Giemsa traipu. 2. versija: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spānija.
3. Klarka G. krāsošanas procedūras (1981), 4.slānis. Viljamss un Vilkinss.
4. Lietišķā klīniskā ķīmija. Giemsa traips in vitro diagnostikai. Izplatītājs: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F un Grazioso C. Giemsa un Lendrum traipu derīgums konjunktīvas uztriepēs Chlamydia trachomatis identificēšanai. Bol of Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212–216.
6. Casas-Rincón G. Vispārējā mikoloģija. 1994. Venecuēlas Centrālās universitātes 2. izdevums, bibliotēkas izdevumi. Venecuēlas Karakasa.
7. "Giemsa traipu." Wikipedia, bezmaksas enciklopēdija. 2017. gada 1. septembris, 01:02 UTC. 2018. gada 6. decembris, es.wikipedia.org.