KATALĀZES PĀRBAUDE: PAMATOJUMS, TEHNIKA UN PIELIETOJUMS - BIOLOĢIJA - 2025

Katalāzes tests ir metodika, ko izmanto bakterioloģija laboratorijās atklāt klātbūtni enzīma katalāzes tajās baktērijas, kas piemīt tā. Kopā ar Gram traipu tie ir galvenie testi, kas jāveic nesen izolētiem mikroorganismiem. Šie testi mikrobiologam palīdz veikt pasākumus, kas jāveic, lai galīgi identificētu attiecīgo mikroorganismu.

Parasti baktērijām, kas satur citohromu, ir enzīms katalāze, kas nozīmē, ka fakultatīvām aerobām un anaerobām baktērijām vajadzētu būt tai. Tomēr ir arī izņēmumi, piemēram, Streptococcus, kuriem, neskatoties uz fakultatīviem anaerobiem mikroorganismiem, nav fermenta katalāzes.

Palaist katalāzes testu, parādot pozitīvu reakciju. Avots: nav sniegts mašīnlasāms autors. Nase pieņemts (pamatojoties uz autortiesību pretenzijām).

Tāpēc katalāzes testu galvenokārt izmanto, lai atšķirtu Staphylococaceae un Micrococaceae ģimenes (abas pozitīvi katalāzes) no Streptococaceae ģimenes (katalāzes negatīvās).

Tāpat arī Bacillus ģints (katalāzes pozitīvs), cita starpā, atšķiras no Clostridium ģints (katalāzes negatīvs).

Pamats

Katalāze ir ferments, kas klasificēts kā hidroperoksidāze, tas nozīmē, ka viņi kā substrātu izmanto ūdeņraža peroksīdu (H ₂ O ₂ ).

To uzskata arī par oksidoreduktāzi, jo reakcijā, kurā tā piedalās, ir elements, kas kalpo kā elektronu donors (reducējoša viela) un cits kā elektronu receptoru (oksidējoša viela).

Katalāze ir proteīns, kas satur proserisku grupu ar četriem trīsvērtīgiem dzelzs atomiem (Fe ⁺⁺⁺ ), tāpēc tas ir homoproteīns. Dzelzs jons reakcijas laikā paliek oksidēts.

Var teikt, ka katalāze ir detoksikācijas enzīms, jo tā funkcija ir likvidēt baktērijām toksiskas vielas, kas rodas baktēriju metabolisma laikā. Starp šīm vielām ir ūdeņraža peroksīds.

Ūdeņraža peroksīds veidojas, sadaloties cukuriem aerobos apstākļos. Šis process notiek šādi:

Superoksīda jons (O ₂ ^- ) (brīvais radikālis) veidojas kā gala produkts glikozes asimilācijā aerobā ceļā. Tas ir toksisks un tiek izvadīts ar enzīma superoksīda dismutāzes palīdzību, kas to pārveido gāzveida skābekļa un ūdeņraža peroksīdā.

Ūdeņraža peroksīds ir toksisks arī baktērijām, tāpēc tas ir jānoņem. Fermenta katalāze sadala ūdeņraža peroksīdu ūdenī un skābeklī.

Katalāze var iedarboties uz substrātiem, kas nav ūdeņraža peroksīds, piemēram, spirtiem, aldehīdiem, skābēm, aromātiskajiem amīniem un fenoliem. Tomēr ūdeņraža peroksīdu katalāze var izmantot arī citu toksisku savienojumu, piemēram, metil- un etilspirta, oksidēšanai.

Tāpat katalāze atrodas fagocītiskajās šūnās, aizsargājot to no ūdeņraža peroksīda toksiskās iedarbības.

Kārtējā metode katalāzes pārbaudei

-Slīdēšanas metode

materiāli

3% ūdeņraža peroksīds (10 tilpumi).

Mikroskopa slaids

Vienreizlietojamais plastmasas rokturis vai koka zobu bakstāmais.

Process

Ņemiet pietiekami daudz kolonijas, lai pētītu, nepieskaroties agaram, no kura tas nāca. Kolonijai jābūt svaigai, tas ir, no 18 līdz 24 stundu kultūras.

Novieto koloniju uz sausā priekšmetstikla un pievieno tai pilienu 3% ūdeņraža peroksīda (var izmantot arī 30% H ₂ O ₂ ). Nekavējoties novērojiet, vai burbuļi izdalās.

Interpretācija

Pozitīva reakcija: gāzes izdalīšanās, par ko liecina burbuļu veidošanās (spēcīga burbuļošana).

Negatīva reakcija: neveidojas burbulis.

-Tieša metode tīrā kultūrā

Ielieciet 1 ml 3% H ₂ O ₂ uz tīras šķīvja vai ķīļa kultūras, kas nesatur asinis (vēlams barības agaru). Novērojiet, vai nekavējoties veidojas burbulis. Var izmantot arī 30% H ₂ O ₂ .

To interpretē tāpat kā porta objekta metodi.

-Metode ar kapilāru caurulīti vai Fung and Petrishko

Ar kapilāru piepildiet 67 mm kapilārā cauruli 20 mm augstumā ar 3% ūdeņraža peroksīdu.

Pieskarieties pētāmajai izolētajai kolonijai ar kapilāru, kas piepildīts ar 3% H ₂ O _{2 .} Novērojiet, vai kapilārs piepildās ar burbuļiem apmēram 10 sekundēs. Šī metode ļauj daļēji kvantificēt reakciju krustos:

Bez krustiem nav burbuļu (negatīva reakcija).

+ ---- maz burbuļu (vāja vai aizkavēta reakcija).

++ --– bagātīgi burbuļi (mērena reakcija).

+++ - burbuļi sasniedz pretējo galu (spēcīga reakcija).

-Taylor un Achanzar metode katalāzes pārbaudēm, kas dod apšaubāmu rezultātu

Novietojiet izolētu koloniju uz tīra, sausa priekšmetstikliņa, pēc tam ielieciet pilienu 0,5% H ₂ O ₂ un pārklājiet ar pārsegu. Novērot, vai neveidojas iesprostoti burbuļi.

Interpretācija: burbuļu klātbūtne norāda uz pozitīvu reakciju. Nav burbuļu, tas tiek interpretēts kā negatīva reakcija.

Mytabacterium sugu katalāzes pārbaude

Šis paņēmiens jāveic, kontrolējot pH un temperatūru. Tas jāveic zem lamināta plūsmas pārsega, jo manipulācijas ar dažādām Mycobacterium sugām ir bīstamas.

-Materiāli

Ūdeņraža peroksīds 30% vai 110 tilpumi (superoksāls).

Fosfāta buferšķīdums pH 7

10% Tween 80

Mycobacterium ķīļa kultūra 3 līdz 4 nedēļas

-Sagatavošana

Fosfāta buferšķīdums pH 7

Svērt:

1,361 g bezūdens monokālija fosfāta (KH ₂ PO ₄ ).

1,420 g bezūdens dinātrija (Na2HPO3) fosfāta.

Izšķīdina abus sāļus nedaudz sterilā destilētā ūdenī un uzpilda līdz 1000 ml ar ūdeni.

10% Tween 80

Veic 1: 10 atšķaidījumu ar Tween 80, kas ir komerciāli koncentrēts, lai to izdarītu šādi:

Ņem 1 ml Tween 80 un ievieto to nedaudz destilētā ūdenī, izšķīdina un pēc tam uzpilda ūdeni līdz 10 ml.

Gatavais reaģents

Sajauc fosfāta buferšķīduma daudzumu ar 10% Tween 80 daudzumu (vienādās daļās). Laboratorijā definējiet, cik daudz jūs vēlaties sagatavot.

-Procesu

Ievietojiet 5 ml fosfāta buferšķīduma sterilā, ar korķi noslēgtā mēģenē (bakelīts).

Ar inokulācijas cilpu ņem pietiekami daudz Mycobacterium augšanas koloniju, kas iesēta ķīļos, un izšķīdina fosfāta buferšķīdumā.

Nostipriniet cauruli, nepārvelkot diegu. Liek ūdens vannā 68 ° C temperatūrā 20 līdz 30 minūtes. Izņem un ļauj atdzist līdz 22-25 ° C

Izmēra 0,5 ml gala reaģenta (samaisa) un pievieno to mēģenē ar aukstu šķīdumu. Ievērojiet burbuļu veidošanos.

To interpretē tāpat kā iepriekšējos paņēmienus.

Izmantojiet

Ja koloniju augšana tiek iegūta bagātinātā vidē, iegūtajām kolonijām jāveic Gram traipu un katalāzes tests. Tas palīdzēs mikrobiologam veikt procedūras, kas jāveic, lai galīgi identificētu.

Avots: sagatavojusi autore MSc. Marielsa gil

QA

Lai novērtētu ūdeņraža peroksīda reaģenta labo sniegumu, izmanto svaigi kultivētus kontroles celmus, piemēram, Staphylococcus aureus kā pozitīvu kontroli un Streptococcus sp celmus kā negatīvu kontroli.

Vēl viena alternatīva, kas kalpo kā pozitīva kontrole, ir asiņa agarā ievietot pilienu ūdeņraža peroksīda, eritrocītos ir katalāze, tāpēc, ja reaģents ir labā stāvoklī, radīsies burbuļošana.

Kā negatīvu kontroli var izmantot šokolādes agaru, šeit eritrocīti jau ir lizēti, un tests ir negatīvs.

Ierobežojumi

- testa veikšanai neizmantojiet vecās kultūras, jo tas var izraisīt nepatiesas negatīvas.

-Neveiciet koloniju ņemšanu no kultūrām uz asins agara, ja esat piesardzīgs, lai nepieskartos agaram; Šī procedūra var izraisīt viltus pozitīvus rezultātus, jo sarkanās asins šūnas satur katalāzi.

-Ja jūs uzņemat koloniju ar platīna rokturi, neatgriezieties procedūras secībā, jo tas var radīt nepatiesus pozitīvus rezultātus. Tas ir tāpēc, ka platīns spēj reaģēt ar ūdeņraža peroksīdu, izraisot burbuļošanos.

-Nelietojiet ūdeņraža peroksīda reaģentu, ja tas ir ļoti vecs, jo reaģents ir ļoti nestabils un tam ir tendence laika gaitā sadalīties.

-Uzglabājiet ūdeņraža peroksīda reaģentu, kas aizsargāts no gaismas un atdzesēts, lai novērstu bojājumus.

-Veiciet ūdeņraža peroksīda reaģenta kvalitātes kontroli katru reizi, kad to lieto.

-Ņem vērā, ka, ja tiek izmantots 30% H ₂ O ₂ , reakcijas ir spēcīgākas nekā tās, kas tiek veiktas ar 3% H ₂ O ₂ .

Atsauces

1. Konemāns E, Allens S, Janda V, Šrekenbergers P, Vins W. (2004). Mikrobioloģiskā diagnostika. 5. ed. Redakcija Panamericana SA Argentīna.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Beilija un Skota mikrobioloģiskā diagnostika. 12 ed. Redakcija Panamericana SA Argentīna.
3. Mac Faddin J. (2003). Bioķīmiskie testi klīniski nozīmīgu baktēriju identificēšanai. 3. ed. Redakcija Panamericana. Buenosairesa. Argentīna.
4. BD laboratorijas. Katalāzes-Gotario reaģents. Pieejams: http://winklerltda.cl
5. Vadequímica laboratorijas. Peroksīds. Apjomu un procentuālā ekvivalence. Pieejams vietnē: vadequimica.com