LÖWENSTEIN-JENSEN BAROTNE: PAMATS, SAGATAVOŠANA UN IZMANTOŠANA - BIOLOĢIJA - 2025

Löwenstein-Jensen vide ir selektīvs ciets vidēja izolēšanai un attīstību baktēriju ģints Mycobacterium, piemēram, Mycobacterium tuberculosis, M. avium, citu starpā, ar izņemot leprae sugas, kas nav Kultivētu.

Mycobacterium ģints baktērijas neaudzē parastajos barotnēs, tāpēc bija nepieciešams izveidot īpašu barotni to izolēšanai. Oriģinālo datu nesēju izveidoja Lēvenšteins, bet vēlāk to pārveidoja Jensens.

Löwenstein-Jensen barotne ar Mycobacterium tuberculosis kolonijām. Avots: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., ar Bioloģijas attēlu bibliotēkas atbalstu

Pārveidošana ietvēra Kongo sarkanās krāsas likvidēšanu, aizstājot to ar lielāku malahīta zaļās koncentrācijas daudzumu. Tas arī mainīja magnija citrāta un monokālija fosfāta koncentrāciju.

Löwenstein-Jensen barotne šobrīd satur kartupeļu cieti, asparagīnu, magnija citrātu, monokālija fosfātu, magnija sulfātu, malahīta zaļo, nalidiksīnskābi, cikloheksimīdu, linkomicīnu, sakultas olas, glicerīnu un ūdeni.

Mikobaktērijas parasti tiek izolētas no vietām, kas nav sterili, piemēram, krēpas, urīns, abscesi. Tas nozīmē, ka lielākajā daļā paraugu būs parastā apgabala mikrobiota, kā arī patogēns.

Tāpēc Löwenstein-Jensen barotne savā sastāvā satur virkni inhibitoru, ko pārstāv malahīta zaļums, antibiotikas un pretsēnīšu līdzekļi.

Turklāt paraugi, kas nāk no nesterilām vietām, pirms iesēšanas Löwenstein-Jensen barotnē ir jādezinficē un jāneitralizē.

Pamats

Olu un glicerīna klātbūtne Löwenstein-Jensen barotnē stimulē mikobaktēriju augšanu, jo tie nodrošina taukskābes un olbaltumvielas, kas vajadzīgas šo mikroorganismu attīstībai.

Löwenstein-Jensen barotne satur malahīta zaļo, kas ir pavadošās mikrobiotas inhibitors. Bet tas satur arī nalidiksīnskābi (35 µg / ml), kas kavē gramnegatīvo mikrobiotu, cikloheksimīdu (400 µg / ml), kas nomāc saprofītiskās sēnes un raugus, un linkomicīnu (2 µ / ml), kas kavē grampozitīvo mikrobiotu.

Dažas tirdzniecības mājas dod priekšroku šādām antibiotiku kombinācijām: polimiksīns B 200 000 vienības / L, amfotericīns B 10 mg / L, karbenicilīns 50 mg / L un trimetoprims 10 mg / L.

Šajā barotnē nav agara, tāpēc barotnes sacietēšana notiek olšūnā esošā albumīna koagulācijas dēļ sterilizācijas laikā.

Sagatavošana

Nosver 37,3 g dehidrētas barotnes 600 ml destilēta ūdens, kam iepriekš ir pievienoti 12 ml glicerīna. Maisījumu karsē, bieži maisot, līdz tas pilnībā izšķīst. Barotni autoklāvā 15 minūtes 121 ° C temperatūrā.

No otras puses, aseptiskos apstākļos jāsagatavo viendabīga 1000 ml svaigu olu suspensija. Pievienojiet olu suspensiju 600 ml barotnes, kas sagatavota 50–60 ° C temperatūrā, izvairoties no gaisa burbuļiem.

Pēc sterilizācijas autoklāvā tiek pievienoti arī antibiotiku šķīdumi.

Ieliet barotni sterilās, ar korķi noslēgtās mēģenēs. Caurulītes 45 minūtes karsē 85 ° C temperatūrā slīpā stāvoklī.

Sagatavotā barotne ir akvamarīna zaļā krāsā, un olu lipīdu klātbūtnes dēļ tajā var būt bālgans plankums.

Barotnes pH jābūt 7,2 ± 0,2

Glabājiet mēģenes ledusskapī un aizsargājiet no tiešas gaismas līdz lietošanai. Temperatūra pirms sēšanas.

Pastāv barotnes modifikācija ar nosaukumu "Löwenstein Jensen Gruft modifikācija". Tas satur tos pašus savienojumus kā klasiskajā barotnē, bet pievieno RNS-5 mg / 100 ml, un kā inhibitori satur malahīta zaļo 0,025 g / 100 ml, penicilīnu 50 V / ml un nalidiksīnskābi 35 ug / ml.

Lietojumprogrammas

Löwenstein-Jensen barotne tiek izmantota mikobaktēriju izdalīšanai no dažāda veida paraugiem. Ziehl-Neelsen traipu ieteicams visiem paraugiem, kuriem ir aizdomas par mikobaktēriju klātbūtni.

Daži paraugi nāk no sterilām vietām, bet citi nē. Nesterilos paraugus attiecīgi dezinficē:

Krēpas

Krēpu paraugus dezinficē šādi: nosaka krēpu parauga daudzumu ml un paraugam pievieno tādu pašu daudzumu 4% NaOH un inkubē 37 ° C temperatūrā.

Bieži sakratiet maisījumu 30 minūšu laikā. Pēc tam 30 minūtes centrifugē ar ātrumu 3000 apgr./min.

Supernatantu izmet virs fenola dezinfekcijas šķīduma. Sējai izmantojiet nogulumus, bet vispirms ir jāneitralizē pH.

Lai neitralizētu nogulsnes, fenola sarkanā indikatora klātbūtnē izmanto 5% H ₂ SO _4, līdz tas sasniedz neitrālu pH, kas izraisa laša krāsu.

Kuņģa skalošana, bronhu skalošana un bronhu aspirācija

Šajā gadījumā paraugu 30 minūtes centrifugē ar ātrumu 3000 apgr./min. Supernatantu izmet un izmanto granulu. Lai noārdītu nogulsnes, pievieno 3 ml 4% NaOH un pusstundu bieži maisa 37 ° C temperatūrā.

Atkal centrifugē, supernatantu izmet un izmanto granulu. Pēdējais ir jāneitralizē, kā paskaidrots krēpu paraugā.

Urīns

Ļauj paraugam 24 stundas nostāvēties ledusskapī. Atdaliet virsējo slāni. Atlikušo granulu 30 minūtes centrifugē ar 3000 RMP. Supernatantu atkal izmet un granulu atjauno ar 3 ml sterila fizioloģiska šķīduma.

Pievieno 3 ml 4% NaOH un turpina dekontamināciju un neitralizēšanu, kā aprakstīts iepriekš.

Ascīta šķidrums, pleiras šķidrums, cerebrospinālais šķidrums

Šāda veida paraugos to centrifugē un virsējo slāni izmet. Veiciet gramu nogulumos vai novērojiet tieši zem mikroskopa; Ja baktērijas netiek novērotas, dekontaminācijas posms un neitralizācijas posms nav nepieciešami.

Šajā gadījumā paraugu var iesēt tieši, izmantojot nogulsnes. Ja ir baktērijas, veiciet dekontamināciju un neitralizēšanu, kā aprakstīts iepriekš.

Biopsijas

Šāda veida paraugiem jāpievieno 5 ml destilēta ūdens, lai tos vēlāk centrifugētu 10 minūtes ar ātrumu 1500 apgr./min. Supernatantu izmet un granulu atkārtoti centrifugē 30 minūtes ar ātrumu 3 500 apgr./min. Izmantojiet nogulumus, lai sētu barotni.

Balsenes uztriepe

Tamponu vajadzētu ievietot sterilā mēģenē, kurā ir vienādās daļās destilēta ūdens un 4% NaOH. Tampons jāpiespiež pie mēģenes sienām tā, lai paraugs būtu atšķaidīts šķidrumā. Centrifugē un izmanto nogulsnes. Neitralizējiet nogulsnes, kā jau aprakstīts.

Sēj

Löwenstein-Jensen barotne tiek inokulēta, uz barotnes virsmas pievienojot 0,5 ml parauga. Pagrieziet mēģeni, lai paraugs izplatītos visā barotnē. Nelietojiet platīna rokturi.

Otro mēģeni, kurā ir Stonebrink barotne, var iesēt, lai izolētu Mycobacterium bovis un citas sugas, kas neaug Löwenstein-Jensen barotnē.

Inkubācija

Inokulētās mēģenes tiek inkubētas aerobos apstākļos 37 ° C temperatūrā, ar vāciņu nedaudz vaļīgu un aptuveni 5 ° slīpi un aizsargātu no gaismas. Vide var būt bagātināta ar 5–10% oglekļa dioksīda. Pārbaudiet kultūras divas reizes nedēļā, līdz parādās kolonijas.

Kad paraugs ir absorbēts, vāciņi tiek pievilkti. Maksimālais inkubācijas laiks ir 8 nedēļas, ja pēc šī laika augšanas nav, to paziņo kā negatīvu.

QA

Kā kvalitātes kontroli var izmantot šādus celmus:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus PyogeCC 196C, 1963, Streptococcus PyogeCoccus ATCC.

Pirmajām trim minētajām sugām gaidāma izcila attīstība, M. fortuitum augšanai vajadzētu būt labai, savukārt M. bovis augšanai nav sagaidāma neliela augšana vai tā nav vērojama vispār. Tikmēr pilnībā jānovērš citas sugas, izņemot ģints Mycobacterium ģints.

Ierobežojumi

Sagatavotā barotne jāaizsargā no gaismas, ilgstoša gaismas iedarbība izraisa barotnes maiņu no zaļas uz zilu, šajā gadījumā barotni vairs nevar izmantot. Tas notiek tāpēc, ka malahīta zaļais ir gaismjutīgs.

Barotni, jo tajā ir olas, var viegli piesārņot, ja ar to nerīkojas aseptiski. To var izšķīdināt, ja tas ir piesārņots ar proteolītiskām baktērijām.

Lai audzētu un apstrādātu Mycobacterium ģints baktērijas, ir nepieciešams kvalificēts personāls, kurš zina par bioloģiskās drošības pasākumiem, kas jāievēro, lai izvairītos no inficēšanās vai citu cilvēku inficēšanas.

Neitralizācijas posmā nedrīkst izmantot HCl, jo veidojas nātrija hlorīds, kas var būt toksisks Koha bacilam.

Paraugi jāuztur atdzesēti un jāsargā no gaismas, kamēr tie netiek apstrādāti.

Atsauce

1. Fransisko Soria Melguizo laboratorijas. 2009. Löwenstein-Jensen selektīvā vide. Pieejams vietnē: f-soria.es
2. Britannia laboratorijas. 2017. Löwenstein-Jensen vide. Pieejams vietnē: britanialab.com.
3. Neogēnu laboratorijas. Lēvenšteina-Jensena vide. Pieejams vietnē: foodsafety.neogen.com.
4. "Löwenstein-Jensen vide." Wikipedia, bezmaksas enciklopēdija. 2018. gada 20. novembris, 15:15 UTC. 2019. gada 24. aprīlis, plkst.18: 34. wikipedia.org
5. Konemans E, Allens S, Janda V, Šrekenbergers P, Vins V. (2004). Mikrobioloģiskā diagnostika. 5. ed. Redakcija Panamericana SA Argentīna.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Beilija un Skota mikrobioloģiskā diagnostika. 12 ed. Redakcija Panamericana SA Argentīna.
7. Mac Faddin J. (2003). Bioķīmiskie testi klīniski nozīmīgu baktēriju identificēšanai. 3. ed. Redakcija Panamericana. Buenosairesa. Argentīna.