DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENILINDOLS): RAKSTUROJUMS, PAMATOJUMS, LIETOJUMS - ĶĪMIJA - 2025

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-Fenilindola) ir krāsu ar fluorescējošu īpašuma kalpo kā ir marķieri, plaši izmanto mākslas fluorescences mikroskopijas vai plūsmas citometrijas, among others. Tās izstarotā fluorescence ir spilgti zila, tās ierosināšana notiek no 455 līdz 461 nm (UV gaisma).

DAPI krāsa ar lielu vieglumu var iziet cauri mirušo šūnu membrānai. Tas var arī nokrāsot dzīvo šūnu kodolus, taču šajā gadījumā to koncentrācijai jābūt augstākai.

Fluorescējošās krāsvielas DAPI ķīmiskā struktūra. Avots: Attēls: Fails: DAPI.svg ir šī faila vektora versija. Tas jāizmanto šī rastra attēla vietā, ja tas nav zemāks / Ričards Vīlers (Zephyris) Rediģēts attēls

Krāsviela ir spējīga piekļūt šūnu DNS, kurai tai ir īpaša afinitāte, ar lielu aviditāti saistoties ar slāpekļa bāzēm adenīnu un timīnu. Šī iemesla dēļ tas ir ļoti noderīgs dažās molekulārās bioloģijas metodēs.

Šis savienojums pieder indola krāsvielu grupai, un ir pierādīts, ka tam ir lielāka jutība pret DNS nekā etiīdija bromīdam un propidija jodīdam, it īpaši uz agarozes želejām.

Šīs fluorescējošās krāsvielas pielietojums ir ļoti plašs, jo tas ir noderīgs: DNS izmaiņu izpētei apoptotiskos procesos (šūnu nāve) un tāpēc šūnu noteikšanai šajā procesā; DNS pēdas nospieduma fotoattēlam (DNS foto drukāšana); izpētīt baktēriju piesārņojumu; vai vizualizēt kodola segmentāciju.

To izmantoja arī hromosomu joslu izpētē, Mycoplasmas sp DNS noteikšanā, DNS-olbaltumvielu mijiedarbībā, šūnu krāsošanā un skaitīšanā ar imūnfluorescences palīdzību un pat nobriedušu putekšņu graudu krāsošanai.

raksturojums

DAPI ir tā ķīmiskā nosaukuma saīsinājums (4 ', 6-diamidino-2-fenilindols). Tā molekulārā formula ir C ₁₆ H ₁₅ N _5. Tā molekulmasa ir 350,3. Netālu no UV gaismas diapazona (345 līdz 358 nm) notiek maksimālā DAPI-DNS kompleksa ierosme, savukārt maksimālā fluorescences emisija notiek starp 455-461 nm.

Šo krāsvielu raksturo kā dzeltenu pulveri, bet struktūras, kas apzīmētas ar šo fluoroforu, izstaro spoži zilu gaismu.

Tas ir ūdenī šķīstošs savienojums, tomēr, lai paātrinātu tā izšķīšanu, var pielietot nedaudz siltuma. To var atšķaidīt ar PBS, bet tieši tajā neizšķīdināt.

Kad krāsviela ir sagatavota, tā jāuzglabā tumsā, tas ir, aizsargātā no gaismas, temperatūrā no 2 līdz 8 ° C (ledusskapī). Šajos apstākļos krāsviela ir stabila ilgāk nekā 3 nedēļas vai mēnešus.

Ja tas ir aizsargāts no gaismas, bet atstāts istabas temperatūrā, tā stabilitāte pazeminās līdz 2 vai 3 nedēļām, bet tiešā apgaismojumā tas pasliktinās ļoti ātri. Ja vēlaties uzglabāt daudz ilgāk, to var atdzesēt -20 ° C temperatūrā, sadalot alikvotās daļās.

Pamats

Šīs krāsošanas pamatā ir kodola virskārtas radīšana galvenajās molekulārās bioloģijas metodēs, piemēram: plūsmas citometrijā, fluorescences mikroskopijā un metafāžu hromosomu vai starpfāžu kodolu krāsošanā, cita starpā.

Šīs tehnikas pamatā ir lielā afinitāte, kas krāsvielai piemīt slāpekļa bāzēm (adenīns un timīns), kas atrodas ģenētiskajā materiālā (DNS) nelielajā rievā. Atrodoties citoplazmā, tas atstāj ļoti mazu fonu.

Kad fluorescējošā krāsa saistās ar DNS adenīna un timīna reģioniem, fluorescence ievērojami palielinās (20 reizes vairāk). Tā izstarotā krāsa ir spilgti zila. Proti, saistoties ar GC (guanīna-citozīna) bāzes pāriem, nav fluorescences emisijas.

Ir svarīgi atzīmēt, ka, lai arī tam ir arī afinitāte pret RNS, tas nerada problēmas, jo šīs molekulas augstākā enerģijas emisijas pakāpe notiek citā viļņa garumā (500 nm), atšķirībā no DNS, kas to dara pie 460 nm. Turklāt fluorescences palielināšanās, kad tā ir saistīta ar RNS, ir tikai par 20%.

DAPI vairāk izmanto mirušu (fiksētu) šūnu krāsošanai nekā dzīvas šūnas, jo pēdējo krāsošanai ir nepieciešama daudz augstāka krāsu koncentrācija, jo šūnu membrāna ir daudz mazāk caurlaidīga DAPI, kad tā ir dzīva.

DAPI krāsu var izmantot kombinācijā ar sarkaniem un zaļiem fluoroforiem, lai iegūtu daudzkrāsu pieredzi.

Izmantojiet

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindols) ir lielisks fluorofors, tāpēc to plaši izmanto dažādās tehnikās un dažādiem mērķiem. Tālāk ir paskaidrots DAPI lietojums galvenajos paņēmienos.

Plūsmas citometrija

Pētnieki Gohde, Schumann un Zante 1978. gadā bija pirmie, kas izmantoja un ierosināja DAPI kā fluoroforu plūsmas citometrijas tehnikā, kam bija lieli panākumi, pateicoties tā augstajai jutībai pret DNS un augstajai fluorescences emisijas intensitātei.

DAPI izmantošana šajā metodē ļauj izpētīt šūnu ciklu, noteikt šūnu daudzumu un nokrāsot dzīvās un mirušās šūnas.

Lai arī ir arī citas krāsvielas, piemēram, etiīdija bromīds, Hohešta oksīds, akridīna apelsīns un propidija jodīds, DAPI ir viens no visplašāk izmantotajiem, jo ​​tas ir daudz fotogaismīgāks nekā iepriekš minētie.

Šim paņēmienam šūnas jānostiprina, šim nolūkam var izmantot absolūto etanolu vai 4% paraformaldehīdu. Paraugu centrifugē un supernatantu izmet, pēc tam šūnas hidratē, 15 minūtes pievienojot 5 ml PBS buferšķīduma.

Laika gaitā sagatavojiet DAPI traipu ar krāsošanas buferi (FOXP3 no BioLegend) koncentrācijā 3 µM.

Paraugu centrifugē, virsējo slāni izmet un pēc tam 15 minūtes istabas temperatūrā pārklāj ar 1 ml DAPI šķīduma.

Ar piemērotu lāzeru ņem paraugu uz plūsmas citometru.

Plūsmas mikrofluorometrija

Vēl viena metode, kurā izmanto DAPI, ir plūsmas mikro-fluorometrijā kopā ar citu fluoroforu, ko sauc par mitramicīnu. Abas ir noderīgas, lai kvantitatīvi noteiktu hloroplasta DNS, bet DAPI ir vislabāk piemērots T4 bakteriofāgu daļiņu mērīšanai.

Hibridizācija

Šajā tehnikā pamatā tiek izmantotas DNS zondes, kas marķētas ar fluorescējošu krāsu, kas var būt DAPI.

Paraugam nepieciešama termiska apstrāde, lai denaturētu divpavedienu DNS un pārvērstu to divos vienpavedienu virzienos. Pēc tam to hibridizē ar DAPI marķētu denaturētu DNS zondi, kurai ir interesējošā secība.

Vēlāk tas tiek mazgāts, lai atdalītu to, kas netika hibridizēts, un DNS vizualizēšanai tiek izmantots kontrasts. Fluorescences mikroskops ļauj novērot hibridizēto zondi.

Šīs tehnikas mērķis ir noteikt specifiskas hromosomu DNS secības, lai varētu diagnosticēt noteiktas slimības.

Šīs citomolekulārās tehnikas ir ļoti palīdzējušas noteikt detaļas kariotipu izpētē. Piemēram, viņš ir parādījis adenozīna un timīna bāzes pāriem bagātos reģionus, ko sauc par heterohromatiskajiem reģioniem vai DAPI joslām.

Šo paņēmienu plaši izmanto hromosomu un hromatīna izpētei augos un dzīvniekos, kā arī pirmsdzemdību un hematoloģisko patoloģiju diagnosticēšanā cilvēkiem.

Šajā metodē ieteicamā DAPI koncentrācija 15 minūtes ir 150 ng / ml.

Saliktie priekšmetstikliņi jāuzglabā aizsargāti no gaismas temperatūrā 2–8 ° C.

Imūnfluorescences krāsošana

Šūnas tiek fiksētas ar 4% paraformaldehīda. Ja ir jāizmanto citi traipi, DAPI beigās paliek kā virskārtas un šūnas 15 minūtes pārklāj ar PBS šķīdumu. Laika gaitā sagatavo DAPI šķīdumu, atšķaidot ar PBS tā, lai galīgā koncentrācija būtu 300 µM.

Pēc tam lieko PBS noņem un 5 minūtes pārklāj ar DAPI. Mazgā vairākas reizes. Priekšmetstikliņu aplūko zem fluorescences mikroskopa zem attiecīgā filtra.

Drošības lapa

Ar šo savienojumu jārīkojas uzmanīgi, jo tas ir savienojums, kam piemīt mutagēnas īpašības. Aktivēto ogli izmanto, lai atdalītu šo savienojumu no ūdens šķīdumiem, kas jāiznīcina.

Lai izvairītos no nelaimes gadījumiem ar šo reaģentu, ir jāizmanto cimdi, halāts un aizsargbrilles. Ja notiek saskare ar ādu vai gļotādu, vieta jānomazgā ar pietiekamu daudzumu ūdens.

Nekādā gadījumā nevajadzētu pipeti šo reaģentu lietot caur muti, lietot pipetes.

Nepiesārņojiet reaģentu ar mikrobiem, jo ​​tas novedīs pie kļūdainiem rezultātiem.

Neatšķaidiet DAPI traipu vairāk, nekā ieteicams, jo tas ievērojami pasliktinās traipa kvalitāti.

Nepakļaujiet reaģentu tiešai gaismai vai turieties siltumā, jo tas samazina fluorescenci.

Atsauces

1. Brammer S, Toniazzo C un Poersch L. Corantes, parasti iesaistīti augu citoģenētikā. Arq Inst. Biol. 2015, 82. Pieejams no: scielo.
2. Impath laboratorijas. DAPI. Pieejams vietnē: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell laboratorijas. 2019. DAPI lietošanas instrukcijas. pieejams vietnē cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Koncepcijas un paņēmieni upju ekoloģijā. (2009). Redakcijas Rubes, Spānija. Pieejams vietnē books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Fluorescences izmantošana modificētā dissektora metodē, lai novērtētu miocītu skaitu sirds audos. Arhīva krūšturi. Kardiols. 2012; 98 (3): 252–258. Pieejams no: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Fitoplazmu klātbūtne papaijā (Carica papaya) Meksikā. Žurnāls Chapingo. Dārzkopības sērija, 2011; 17 (1), 47-50. Pieejams vietnē: scielo.org.