CITOĶĪMIJA: VĒSTURE, PĒTĪJUMA OBJEKTS, LIETDERĪBA UN PAŅĒMIENI - BIOLOĢIJA - 2025

Cytochemistry ietver virkni paņēmienu, kas balstās uz identificēšanu un dispozīciju konkrētu vielu šūnā. To uzskata par šūnu bioloģijas nozari, kas apvieno šūnu morfoloģiju ar ķīmisko struktūru.

Pēc Benslija teiktā, mūsdienu citoloģijas pielietojuma dibinātājs, pauž, ka citoķīmijas mērķis ir atklāt šūnu ķīmisko organizāciju, lai izprastu dzīves noslēpumus. Kā arī pēta dinamiskās izmaiņas, kas notiek dažādos funkcionālajos posmos.

1: Pedžeta ārpusdzemdes slimība. (Hematoksilīns-eozīns) 2: seniālās plāksnes, kas novērotas smadzeņu garozā pacientam ar Alcheimera slimību. (Sudraba impregnēšana) 3: Truša mēle, Kolagēna šķiedras (zilas). Muskuļu šķiedras (violetas sloksnes). (Masson trihroms). 4: aknu audi ar tauku deģenerāciju. (Sudāna III) 5: iekaisušas aknas. Nekroze. (Toluidīna zils) Avoti: Wikipedia. com / Lietotājs: KGH / Publiskā domēna faili / Mohit Lalwani

Tādā veidā ir iespējams noteikt šo vielu metabolisko lomu šūnā.

Citoķīmijā tiek izmantotas divas galvenās metodes. Pirmais ir balstīts uz ķīmiskām un fizikālām procedūrām. Šīs metodes izmanto mikroskopa izmantošanu kā neaizstājamu instrumentu, lai vizualizētu ķīmiskās reakcijas, kas notiek ar īpašām vielām šūnā.

Piemērs: citoķīmisko krāsvielu izmantošana, piemēram, Feulgena reakcija vai PAS reakcija.

Otrās metodes pamatā ir bioķīmija un mikroķīmija. Izmantojot šo metodiku, ir iespējams kvantitatīvi noteikt starpšūnu ķīmisko vielu klātbūtni.

Starp vielām, kuras var atklāt audu vai šūnu struktūrā, ir šādas: olbaltumvielas, nukleīnskābes, polisaharīdi un lipīdi.

Citoķīmijas vēsture

Citoķīmiskās metodes kopš to izgudrošanas ir palīdzējušas izprast šūnu sastāvu, un laika gaitā ir parādījušās dažādas metodes, kurās tiek izmantoti dažāda veida krāsvielas ar atšķirīgu piederību un pamatiem.

Pēc tam, izmantojot noteiktus substrātus, citoķīmija atvēra jaunus apvāršņus, lai kolorimetriski parādītu enzīmu vai citu molekulu klātbūtni šūnā.

Tāpat ir parādījušās citas metodes, piemēram, imūncitoķīmija, kas ir ļoti palīdzējusi daudzu slimību diagnosticēšanā. Imūncitoķīmija ir balstīta uz antigēnu un antivielu reakcijām.

No otras puses, citoķīmijā ir izmantotas arī fluorescējošas vielas, ko sauc par fluorohromiem, kas ir lieliski marķieri noteiktu šūnu struktūru noteikšanai. Sakarā ar fluorohroma īpašībām tas izceļ struktūras, pie kurām tas ir piestiprināts.

Ko tu mācies?

Dažādām citoķīmiskām metodēm, kuras tiek izmantotas bioloģiskajā paraugā, ir kaut kas kopīgs: tās atklāj noteikta veida vielas klātbūtni un zina tās atrašanās vietu vērtējamajā bioloģiskajā struktūrā, neatkarīgi no tā, vai tas ir šūnas tips vai audi.

Šīs vielas var būt fermenti, smagie metāli, lipīdi, glikogēns un noteiktas ķīmiskās grupas (aldehīdi, tirozīns utt.).

Šo metožu sniegtā informācija var sniegt norādījumus ne tikai šūnu identificēšanai, bet arī dažādu patoloģiju diagnosticēšanai.

Piemēram, citoķīmiskie traipi ir ļoti noderīgi, lai atšķirtu dažādu veidu leikēmijas, jo dažas šūnas izsaka noteiktus enzīmus vai galvenās vielas, bet citas - ne.

No otras puses, jāatzīmē, ka, lai varētu izmantot cito ķīmiju, ir jāņem vērā šādi apsvērumi:

1) Vielai jābūt imobilizētai vietā, kur tā dabiski atrodama.

2) viela jāidentificē, izmantojot substrātus, kas īpaši reaģē ar to, nevis ar citiem savienojumiem.

Lietderība

Paraugi, kurus var izpētīt, izmantojot citoķīmiskās metodes, ir:

- paplašinātas perifēras asinis.

- pagarināts kaulu smadzenes.

- audi, kas fiksēti histoķīmiskajām metodēm.

- šūnas, kas fiksētas ar citocentrifugēšanu.

Citoķīmiskās metodes ir ļoti atbalstošas ​​hematoloģijas jomā, jo tās plaši izmanto, lai palīdzētu diagnosticēt un diferencēt noteikta veida leikēmijas.

Piemēram: esterāzes reakcijas izmanto, lai atšķirtu mielomonocītisko leikēmiju no akūtas monocītiskās leikēmijas.

Šo pacientu kaulu smadzeņu un perifēro asiņu uztriepes ir līdzīgas, jo dažas šūnas ir grūti identificēt tikai morfoloģiski. Šim nolūkam tiek veikts esterāzes tests.

Pirmajā konkrētās esterāzes ir pozitīvas, savukārt otrajā nespecifiskās esterāzes ir pozitīvas.

Tie ir ļoti noderīgi arī histoloģijā, jo, piemēram, smago metālu krāsošanas tehnika (impregnēšana ar sudrabu) iekrāso miokarda audos intensīvas brūnas krāsas retikulārās šķiedras.

Metodes citoķīmijā

Zemāk tiks izskaidroti visbiežāk izmantotie paņēmieni:

- Krāsvielu lietošana

Cietoķīmiskajā tehnikā izmantotie traipi ir ļoti dažādi, un tos var klasificēt pēc vairākiem skatu punktiem:

Saskaņā ar radikāli, pret kuru viņiem ir radniecība

Tos iedala: skābos, bāziskos vai neitrālos. Tie ir visvienkāršākie un visvairāk izmantotie visā vēsturē, ļaujot atšķirt bazofīlos komponentus no acidofiliem. Piemērs: hematoksilīna-eozīna krāsošana.

Šādā gadījumā šūnu kodoli iekrāsojas zilā krāsā (tie uzņem hematoksilīnu, kas ir pamata traips) un citoplazmas, sarkanā krāsā (tās uzņem eozīnu, kas ir skābes traips).

Atbilstoši to krāsai

Tie var būt ortromatiski vai metahromatiski. Ortromatiskie līdzekļi ir tie, kas krāso tādas pašas krāsas struktūras, kādas ir krāsvielai. Piemēram, eozīna gadījums, kura krāsa ir sarkana un iekrāsojas sarkana.

No otras puses, metakromatikas krāso atšķirīgu krāsu nekā tās, piemēram, toluidīns, kura krāsa ir zila un tomēr tā ir violeta.

Vital vai supravital krāsvielas

Tās ir nekaitīgas krāsvielas, tas ir, tās krāso šūnas un tās paliek dzīvas. Šos traipus sauc par dzīvībai svarīgiem (piemēram, no tripāna zila līdz makrofāgu krāsošanai) vai par supravitāli (piemēram, Janus zaļš, lai traipu mitohondriji, vai neitrāli sarkani, lai traipu lizosomas).

- Lipīdu noteikšana ar taukos šķīstošu krāsvielu palīdzību

Osmija tetroksīds

Tas iekrāso lipīdus (nepiesātinātās taukskābes) melnā krāsā. Šo reakciju var novērot ar gaismas mikroskopu, bet, tā kā šai krāsvielai ir augsts blīvums, to var vizualizēt arī ar elektronu mikroskopu.

Sudāna III

Tas ir viens no visvairāk izmantotajiem. Šī krāsa izkliedējas un izšķīst audos, uzkrājoties lipīdu pilienu iekšpusē. Krāsa ir koši sarkana.

Sudānas melns traips B

Tas rada labāku kontrastu nekā iepriekšējie, jo spēj izšķīst arī fosfolipīdos un holesterīnā. Tas ir noderīgi, lai noteiktu nobriedušu granulocītu un to prekursoru azurofīlas un specifiskas granulas. Tāpēc tas identificē mieloīdās leikēmijas.

- Aldehīdu grupas iekrāsošana (periodiski skābes Schiff traips)

Periodiski skābi Šifa traipi var noteikt trīs veidu aldehīdu grupas. Viņi ir:

- brīvie aldehīdi, kas dabiski atrodas audos (plazmas reakcija).

- Aldehīdi, kas iegūti selektīvā oksidācijā (PAS reakcija).

- Aldehīdi, kas radušies selektīvās hidrolīzes rezultātā (Feulgena reakcija).

PAS reakcija

Šīs krāsošanas pamatā ir noteikta veida ogļhidrātu, piemēram, glikogēna, noteikšana. Periodiski skābais Šifs sabojā ogļhidrātu CC saites, pateicoties 1-2 glikolgrupu oksidācijai, tādējādi izdalot aldehīdu grupas.

Brīvās aldehīdu grupas reaģē ar Šifa reaģentu un veido purpursarkanu savienojumu. Violeti sarkanās krāsas izskats parāda pozitīvu reakciju.

Šis tests ir pozitīvs augu šūnās, atklājot cieti, celulozi, hemicelulozi un peptīnus. Atrodoties dzīvnieku šūnās, tas atrod mucīnus, mukoproteīnus, hialuronskābi un hitīnu.

Turklāt tas ir noderīgs arī limfoblastiskās leikēmijas vai eritroleikēmijas diagnosticēšanā, kā arī citas mielodisplastiskā tipa patoloģijas.

Skābu ogļhidrātu gadījumā var izmantot alciāna zilo traipu. Tests ir pozitīvs, ja tiek novērota gaiši zila / tirkīza krāsa.

Plazmas reakcija

Plazmas reakcija atklāj noteiktu garu ķēžu alifātisko aldehīdu, piemēram, palmu un stearālo, klātbūtni. Šo paņēmienu piemēro sasaldētām histoloģiskām sekcijām. To apstrādā tieši ar Šifa reaģentu.

Neskaidra reakcija

Šis paņēmiens nosaka DNS klātbūtni. Metode sastāv no fiksēto audu pakļaušanas vāji skābai hidrolīzei, lai vēlāk tie reaģētu ar Šifa reaģentu.

Hidrolīze pakļauj dezoksiribozes aldehīdu grupas pie dezoksiribozes-purīna saites. Pēc tam Šifa reaģents reaģē ar aldehīdu grupām, kuras tika atstātas brīvas.

Šī reakcija ir pozitīva kodolos un negatīva šūnu citoplazmās. Pozitivitāti apliecina sarkanās krāsas klātbūtne.

Ja šo paņēmienu apvieno ar metilzaļo-pironīnu, ir iespējams vienlaikus noteikt DNS un RNS.

- olbaltumvielu struktūru citoķīmiskie traipi

Šim nolūkam var izmantot Millona reakciju, kurā par reaģentu izmanto dzīvsudraba nitrātu. Aromātiskās aminoskābes saturošās struktūras iekrāsojas sarkanā krāsā.

- citoķīmiskie traipi, kas izmanto substrātus, lai parādītu enzīmu klātbūtni

Šo traipu pamatā ir bioloģiskā parauga inkubācija ar īpašu substrātu, un reakcijas produkts pēc tam reaģē ar diazo sāļiem, veidojot krāsainu kompleksu.

Esterāzes

Šie fermenti atrodas dažu asins šūnu lizosomās un spēj hidrolizēt organiskos esterus, kas atbrīvo naftolu. Pēdējais veido nešķīstošu azo krāsvielu, kad tā saistās ar diazo sāli, krāsojot vietu, kur notiek reakcija.

Ir vairāki substrāti, un atkarībā no tā, kurš tiek izmantots, var identificēt specifiskas esterāzes un nespecifiskas esterāzes. Pirmie atrodas mieloīdu sērijas nenobriedušās šūnās, bet otrie - monocītiskas izcelsmes šūnās.

Specifisko esterāžu noteikšanai izmanto substrātu: naftola-AS-D hloracetāts. Nespecifisko esterāžu noteikšanai var izmantot vairākus substrātus, piemēram, naftola AS-D acetātu, alfa naftilacetātu un alfa naftilbutirātu.

Abos gadījumos šūnas būs iekrāsojušās sarkanā krāsā, kad reakcija būs pozitīva.

Mieloperoksidāze

Šis ferments ir atrodams granulocītisko šūnu un monocītu azurofīlajās granulās.

Tās noteikšanu izmanto, lai diferencētu mieloīdās izcelsmes leikēmijas no limfoīdām. Šūnas, kas satur mieloperoksidāzes, kļūst okoldes dzeltenas.

Fosfatāzes

Šie fermenti atbrīvo fosforskābes no dažādiem substrātiem. Tie atšķiras viens no otra pēc pamatnes īpatnībām, pH un inhibitoru un inaktivatoru darbības.

Starp pazīstamākajiem ir fosfonoonoesterāzes, kas hidrolizē vienkāršos esterus (PO). Piemērs: sārmainā fosfatāze un skābā fosfatāze, kā arī fosfamidāzes, kas hidrolizē saites (PN). Tos izmanto, lai diferencētu limfoproliferatīvos sindromus un matains šūnu leikēmijas diagnosticēšanai.

- trihromatiskas krāsas

Malāra-Azāna trihroms

Tie ir noderīgi, lai atšķirtu šūnu citoplazmu no saistaudu šķiedrām. Šūnas iekrāsojas sarkanā krāsā, bet kolagēna šķiedras - zilas.

Masson trihroms

Tam ir tāda pati lietderība kā iepriekšējam, taču šajā gadījumā šūnas iekrāsojas sarkanā krāsā, un kolagēna šķiedras ir zaļas.

- Krāsvielas, kas krāso specifiskus organellus

Janušs Grīns

Tas selektīvi krāso mitohondrijus.

Sudraba sāļi un osmīnskābe

Krāso Golgi aparātu.

Toluidīna zils

Krāso Nissi ķermeņus

Sudraba sāļi un PAS

Viņi iekrāso retikulārās šķiedras un bazālo slāni.

Orceīna un fuksīna rezorcīns

Viņi krāso elastīgās šķiedras. Ar pirmo tie ir krāsoti brūnā krāsā, bet ar otro - dziļi zilā vai purpursarkanā krāsā.

- Citas metodes, ko izmanto citoķīmijā

Fluorescējošu vielu vai fluorohromu izmantošana

Ir paņēmieni, kas izmanto fluorescējošas vielas, lai pētītu struktūras atrašanās vietu šūnā. Šīs reakcijas tiek vizualizētas ar īpašu mikroskopu, ko sauc par fluorescenci. Piemērs: SFI paņēmiens (netieša imūnfluorescence).

Šūnu komponentu noteikšana ar imūncitoķīmiju

Šīs metodes ir ļoti noderīgas medicīnā, jo tās palīdz noteikt noteiktu šūnu struktūru un arī to kvantitatīvi noteikt. Šīs reakcijas pamatā ir antigēna-antivielas reakcija. Piemēram: ELISA metodes (Enzyme Immuno Assay).

ieteikumi

- Lai novērtētu labu krāsvielu darbību, ir jāizmanto kontroles uztriepes.

- Lai veiktu citoķīmisko krāsošanu, jāizmanto svaigas uztriepes. Ja tas nav iespējams, tie jātur aizsargāti no gaismas un jāuzglabā 4 ° C temperatūrā.

- Jāuzmanās, lai izmantotais fiksācijas līdzeklis negatīvi neietekmētu pētāmo vielu. Citiem vārdiem sakot, tas ir jānovērš no iespējas to iegūt vai kavēt.

- Jāievēro fiksatoru lietošanas laiks, jo parasti tam vajadzētu būt tikai dažām sekundēm, jo ​​ilgāku laiku uzliekot uztriepi fiksējošajam, tas var sabojāt dažus fermentus.

Atsauces

1. "Citoķīmija." Wikipedia, bezmaksas enciklopēdija. 2018. gada 30. jūnijs, 17:34 UTC. 2019. gada 9. jūlijs, 02:53 Pieejams: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Miokarda retikulāro šķiedru izpētes metāliskās impregnēšanas metodes: salīdzinošais pētījums. RFM 2002; 25 (2): 224–230. Pieejams vietnē: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Skābes fosfatāzes citoķīmija: metodoloģiski apsvērumi. Diagn. Biol., 200; 50 (2): 89-92. Pieejams vietnē: scielo.org
4. De Roberts E, De Roberts M. (1986). Šūnu un molekulārā bioloģija. 11. izdevums. Redakcijas Ateneo. Buenosairesā, Argentīnā.
5. Klasiski rīki šūnu bioloģijas studijām. TP 1 (papildu materiāls) - šūnu bioloģija. Pieejams vietnē: dbbe.fcen.uba.ar