SPORAS KRĀSOŠANA: PAMATOJUMS, PAŅĒMIENI UN PIELIETOJUMS - BIOLOĢIJA - 2025

Sporu krāsojumam ir metodika, ko izmanto, lai krāsu pretestības struktūras, kas veido kādu baktēriju ģintis kad nelabvēlīgos apstākļos; Šīs struktūras atbilst izdzīvošanas formai.

Ir daudz ģinšu, kas veido sporas; tomēr galvenie ir Bacillus un Clostridium. Šīs ģintis tiek uzskatītas par piemērotākām, jo ​​tām ir patogēnas sugas cilvēkiem.

Sporas iekrāsošana ar Šaefera - Fultona vai Wirtz-Conklin metodi. Tambe (oriģinālais augšupielādētājs) no Wikimedia Commons

Katrs bacils var izraisīt sporas veidošanos. Preparāta krāsošanas laikā sporas var atrast bacilā (endospora) vai ārpus tā (exospora). Izmantojot tradicionālās baktēriju krāsošanas metodes, piemēram, Gram traipu, sporas paliek bezkrāsainas.

Pašlaik ir vairākas krāsošanas metodikas, kas spēj iekļūt biezā sporas struktūrā, lai to krāsotu. Šīs metodoloģijas ir ļoti dažādas; Tie ietver Dornera paņēmienu, Mēlera traipu un Šafera - Fultona metodiku, kas pazīstama arī kā Wirtz-Conklin.

No visām minētajām metodēm Šaefera-Fultona metodika ir visplašāk izmantotā ikdienas laboratorijās. Tas ir nosaukts pēc diviem mikrobiologiem, kuri 1930. gadā izveidoja krāsojumu: Alicia Shaeffer un MacDonald Fulton. Tomēr šo metodi dažreiz sauc par Wirtz-Conklin pēc diviem bakteriologiem no 1900. gadiem.

Pamats

Sporas nekrāsojas ar parastajiem traipiem, jo ​​tām ir ļoti bieza siena. Sporas sarežģītais sastāvs neļauj iekļūt lielākajai daļai krāsvielu.

Ja sporas tiek pētītas no ārpuses, novēro šādus slāņus: pirmkārt, ir eksosporijs, kas ir plānākais un ārējais slānis, ko veido glikoproteīni.

Tālāk nāk kutikula, kas nodrošina izturību pret augstām temperatūrām, kam seko garozs, kas sastāv no peptidoglikāna. Vēlāk ir pamatnes siena, kas aizsargā protoplastu.

Spora ir dehidrēta struktūra, kas satur 15% kalcija un dipikolinīnskābes. Tāpēc lielākā daļa sporu krāsošanas paņēmienu paļaujas uz siltuma pielietojumu, lai krāsviela varētu iekļūt biezā struktūrā.

Kad spora ir iekrāsota, tā nevar noņemt krāsvielu. Šaefera - Fultona tehnikā malahīta zaļš iekļūst veģetatīvās šūnās un, kad tiek uzlikts karstums, iekļūst endosporā, kā arī eksosporās.

Mazgājot ar ūdeni, krāsvielu noņem no veģetatīvās šūnas. Tas notiek tāpēc, ka malahīta zaļā krāsa ir nedaudz pamata, tāpēc tā vāji saistās ar veģetatīvo šūnu.

Tā vietā tas nevar izkļūt no sporām, un galu galā baktērijas tiek apkontrolētas ar safranīnu. Šis pamats ir spēkā pārējiem paņēmieniem, kuros notiek kaut kas līdzīgs.

Sporas krāsošanas paņēmieni

Lai veiktu sporu krāsošanu, jāiegūst tīra pētāmo aizdomīgo celmu kultūra.

Kultūru 24 stundas pakļauj galējai temperatūrai, lai stimulētu mikroorganismu sporulāciju. Šim nolūkam kultūru var ievietot cepeškrāsnī 44 ° C vai ledusskapī (8 ° C) 24 vai 48 stundas.

Ja tos pārāk ilgi atstāj minētajās temperatūrās, tiks novērotas tikai eksosporas, jo visas endosporas jau būs izgājušas no bacilas.

Laika beigās uz tīra priekšmetstikla jānovieto daži pilieni sterila fizioloģiska šķīduma. Tad tiek ņemta neliela kultūras daļa un veikta smalka izkliedēšana.

Pēc tam to atstāj nožūt, nostiprina siltumā un krāso ar vienu no turpmāk aprakstītajiem paņēmieniem:

Dornera tehnika

1- Mēģenē sagatavo koncentrētu sporētu mikroorganismu suspensiju destilētā ūdenī un pievieno vienādu daudzumu filtrēta Kiniljona karbola fuksīna.

2- Novietojiet mēģeni vannā ar verdošu ūdeni no 5 līdz 10 minūtēm.

3- Uz tīra priekšmetstikla samaisa pilienu iepriekšējās suspensijas ar pilienu 10% nigrosīna ūdens šķīduma, uzvāra un filtrē.

4- Ar nelielu karstumu ātri izklājiet un nožāvējiet.

5- Pārbaudiet ar objektīvu 100X (iegremdēšana).

Sporas iekrāsojas sarkanā krāsā, un baktēriju šūnas izskatās gandrīz bezkrāsainas uz tumši pelēka fona.

Pārveidota Dornera tehnika

1- Sporēta mikroorganisma suspensija tiek izkliedēta uz priekšmetstikliņa un nostiprināta siltumā.

2- Paraugs ir pārklāts ar filtrpapīra sloksni, kurai pievieno karbola fuksīnu. Krāsvielu karsē 5 līdz 7 minūtes ar Bunsena degļa liesmu, līdz veidojas tvaiki. Tad papīrs tiek noņemts.

3- Preparātu mazgā ar ūdeni un pēc tam žāvē ar absorbējošu papīru.

4- Nosedziet uztriepi ar plānu 10% nigrosīna plēvi, izmantojot otro priekšmetstikliņu, lai izplatītu nigrosīnu vai adatu.

Sporu un baktēriju iekrāsojums ir tāds pats, kā aprakstīts iepriekšējās tehnikas līmenī.

Shaeffer - Fulton vai Wirtz-Conklin tehnika

1- Uz priekšmetstikla izveidojiet smalku uztriepi ar sporētā mikroorganisma suspensiju un nostipriniet to uz karstuma.

2- Pārklājiet priekšmetstikliņu ar 5% malahīta zaļš ūdens šķīdumu (uz priekšmetstikliņa varat ievietot filtrpapīru).

3 - Uzkarsējiet virs Bunsena degļa liesmas, lai atbrīvotos tvaiki, un noņemiet liesmu. Atkārtojiet darbību 6 līdz 10 minūtes. Ja malahīta zaļais šķīdums procedūras laikā pārāk daudz iztvaiko, var pievienot vairāk.

4- Noņemiet filtrpapīru (ja tāds ir) un mazgājiet ar ūdeni.

5- Pārklājiet priekšmetstikliņu ar 0,5% ūdens safranīna 30 sekundes (dažos tehnikas variantos izmanto 0,1% ūdens safranīna un atstājiet to 3 minūtes).

Izmantojot šo paņēmienu, sporas kļūst zaļas un baciļi sarkanas.

Tam ir trūkums, ka jauno kultūru endosporas nav labi iekrāsojas, jo tās ir ārkārtīgi dzidras vai bezkrāsainas. Lai no tā izvairītos, ieteicams izmantot 48 stundu inkubācijas kultūras.

Mēlera tehnika

1- 2 minūtes pārklājiet uztriepi ar hloroformu.

2 - Izmetiet hloroformu.

3 - 5 minūtes pārklājiet ar 5% hromskābi.

4 - Mazgāt ar destilētu ūdeni

5- loksne ir pārklāta ar karbola fuksīna-fenikādi un tiek pakļauta Bunsena degļa liesmai, līdz izdalās tvaiki; tad uz dažiem mirkļiem to noņem no liesmas. Darbību atkārto, līdz 10 minūtes ir pabeigtas.

6- Nomazgājiet ar ūdeni.

7- Lai mainītu krāsu, izmantojiet paskābinātu etanolu (sālsspirtu). To atstāj uz 20 vai 30 sekundēm.

8- Nomazgājiet ar destilētu ūdeni.

9 - Kontrastējiet, pārklājot loksni ar metilēnzilo 5 minūtes.

10- Nomazgājiet ar destilētu ūdeni.

11. Ļaujiet tai nožūt, un paraugu ņem mikroskopā.

Sporas parādās sarkanā krāsā, bet baciļi - zilā krāsā. Ir svarīgi neieelpot tvaikus, jo tie ir toksiski un ilgtermiņā var būt kancerogēni.

Pārveidota Möeller tehnika bez karstuma

2007. gadā Hayama un viņa līdzstrādnieki izveidoja Möeller tehnikas modifikāciju. Viņi atteicās no krāsošanas karsēšanas un aizstāja to, pievienojot 2 pilienus virsmaktīvās vielas Tergitol 7 uz katriem 10 ml karbola fuksīna-karbola šķīduma. Tādi paši rezultāti tika iegūti.

Lietojumprogrammas

Sporas iekrāsojot sniedz ļoti vērtīgu un noderīgu informāciju patogēna identificēšanai, jo tā klātbūtne, forma, atrašanās baciļā un spēja deformēt veģetatīvo šūnu vai nē, ir dati, kas var vadīt sugas iesaistīti noteiktā žanrā.

Šajā kontekstā ir vērts teikt, ka sporas var būt apaļas vai ovālas, tās var atrasties centrā vai arī paracentra, zemūdens vai terminālā stāvoklī.

Endosporas un eksosporas formas un novietojuma diagramma

Piemēri

- Clostridium difficile terminālā stāvoklī veido ovālu sporu, kas deformē bacilu.

- Clostridium tertium spora ir ovāla, nedeformē bacilu un atrodas termināļa līmenī.

- Clostridium tetani endospora ir termināla un deformē bacillus, nodrošinot stilbiņa izskatu.

- Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy un C. septicum sporas ir apaļas vai zemādas ovālas formas un deformē bacilu.

- Clostridium sordelli endospora atrodas centrālā stāvoklī ar nelielu deformāciju.

Konemāns E, Allens S, Janda V, Šrekenbergers P, Vins W. (2004). Mikrobioloģiskā diagnostika. (5. izd.). Argentīna, Panamericana SA redakcija

Atsauces

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Vienkāršotas metodes ierosinājums baktēriju sporu krāsošanai, nepiemērojot siltumu - veiksmīga Moellera metodes modifikācija. Eur J Med Res., 2007; 16 12 (8): 356–9.
2. Wikipedia līdzautori. Moellera traips. Wikipedia, bezmaksas enciklopēdija. 2018. gada 3. novembris, 03:28 UTC. Pieejams: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Mikrobioloģisko paņēmienu laboratorijas rokasgrāmata. Mikrobioloģijas akadēmijas Pamatzinātņu katedra. Nacionālais politehniskais institūts.
4. "Endospors." Wikipedia, bezmaksas enciklopēdija. 2018. gada 25. februāris, plkst.10: 20 UTC. 2019. gada 10. janvāris, 02:42: lv.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J un līdzstrādnieki. (2006). Extremadura autonomās kopienas leiboristu personāls. Īpašās programmas IV sējums. Redakcija MAD. Sevilja-Spānija, 211.-212.lpp.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), Galisijas veselības dienesta (SERGAS) laboratorijas tehniķis. Konkrētas tēmas darba kārtības sējums 2. Redakcijas MAD. Sevilja – Spānija, 79. – 80. Lpp.
7. Konemāns E, Allens S, Janda V, Šrekenbergers P, Vins W. (2004). Mikrobioloģiskā diagnostika. (5. izd.). Argentīna, Panamericana SA redakcija
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Beilija un Skota mikrobioloģiskā diagnostika. 12 ed. Argentīna. Redakcija Panamericana SA