FOSFĀTA BUFERŠĶĪDUMS (GAB.): PAMATOJUMS, SAGATAVOŠANA UN LIETOJUMS - BIOLOĢIJA - 2025

Fosfāta buferšķīdums, fosfātu buferšķīdums vai BPS ir buferis izotonisks, kura funkcija ir , lai saglabātu pH un osmotisko spiedienu, kas ir tuva dabiskā bioloģisko vidi (fizioloģiskā). Saīsinājums PBS apzīmē fosfātu buferšķīdumu.

PH un osmolaritāte ir divi ļoti svarīgi aspekti, kas jākontrolē noteiktos laboratorijas protokolos. PH gadījumā ir svarīgi to kontrolēt, īpaši bioķīmiskās reakcijās, jo tās var mainīties vai arī tās nenotiek, ja reaģentu pH ir nepiemērots.

PBS fosfāta buferšķīdums pie diviem dažādiem pH līmeņiem. Avots: Pixinio.com

Tikmēr osmolaritātes kontrole ir būtiska, īpaši strādājot ar dzīvām šūnām, jo ​​šūnu plazmas membrānas reaģē atbilstoši izšķīdušo vielu koncentrācijai, kurā tās atrodas.

Ja šūnas tiek pārnestas uz hipertonisku barotni, tās tiks dehidrētas, jo ūdens gradients tiks pārvietots uz to pusi, kur ir augstāka izšķīdušo vielu koncentrācija. No otras puses, ja šūnas tiek ievietotas hipotoniskā vidē, šūnas absorbēs šķidrumu, līdz tās tiks lizētas.

Tāpēc PBS buferšķīdumu izmanto laboratorijas protokoliem, kuriem nepieciešama šūnu uzturēšana in vitro, šādā veidā šūnas netiks sabojātas.

PBS veido tādu sāļu kombinācija kā nātrija hlorīds, nātrija fosfāts, kālija hlorīds un kālija fosfāts. PBS sastāvs var mainīties atkarībā no protokola.

Pamats

Pamatā fosfāta buferšķīduma funkcija ir uzturēt nemainīgu fizioloģisko pH līmeni kopā ar elektrolītu koncentrāciju, kas līdzīga tai, kas atrodas ķermeņa iekšienē.

Šajā vidē šūnas spēj saglabāt stabilitāti, jo fizioloģiskos apstākļus cik vien iespējams imitē.

Obligātajam PBS sastāvam vajadzības gadījumā var pievienot citus savienojumus, piemēram, EDTA pievienošana buferšķīdumam ir noderīga sarkano asins šūnu mazgāšanai krusteniskās nesaderības testā.

EDTA novērš serumā esošās C1 komplementa frakcijas šķelšanos un lizēšanu eritrocītos, tas ir, tas ļauj izvairīties no kļūdainiem nesaderības rezultātiem. Turklāt EDTA palīdz disociēt šūnas.

Sagatavošana

Sāļu daudzums, kas jāsver, lai sagatavotu PBS ar fosfātu buferšķīdumu, būs atkarīgs no pagatavojamā daudzuma:

-Fosfāta buferēts fizioloģiskā šķīduma rezerves šķīdums (10x PBS)

Par vienu litru šķīduma:

Svērt:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11.5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Pagatavošanas tehnika

Ievietojiet smagos sāļus vārglāzē, pievienojiet pietiekami daudz ūdens (80%) un samaisiet uz maisīšanas plāksnes ar magnētisko stieni, līdz sāļi izšķīst.

PBS sagatavošana, izmantojot maisīšanas plāksni ar magnētisko stieni. Avots: Lietotājs: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtrē, lai noņemtu neizšķīdušās daļiņas. Izmantojiet filtrus ar 0,45 µm porām. Autoklāvā un aseptiski sadaliet laminārā plūsmas nosūcējā stikla burkās ar vākiem.

10X šķīdums (koncentrēts) nepielāgo pH. Pielāgošana tiek veikta pēc atšķaidīšanas līdz 1X PBS buferšķīduma koncentrācijai (atšķaidījums 1:10).

- buferšķīduma fosfāta šķīdums (1X PBS)

1X PBS var pagatavot tieši, nosverot katra sāls atbilstošos daudzumus, vai arī to var pagatavot, atšķaidot izejas šķīdumu (1:10) ar sterilu destilētu ūdeni.

-Lai tieši pagatavotu litru 1X PBS fosfāta buferšķīduma, nosver:

8,06 g NaCl,

0,22 g KCl,

1.15 g Na ₂ HPO ₄ ,

0.20 g of KH ₂ HPO ₄

Pagatavošanas tehnika

Rīkojieties, kā paskaidrots koncentrētajā šķīdumā. Pēc tam pH ir jākoriģē. Lai to izdarītu, izmēra pH un atkarībā no rezultāta izmanto skābi (HCl) vai bāzi (NaOH), lai attiecīgi pazeminātu vai paaugstinātu pH, līdz tas ir 7,4.

Skābi vai bāzi pievieno pa pilienam, pārraugot šķīduma pH vērtību, izmantojot pH metru. Filtrējiet, autoklāvējiet un pēc vajadzības aseptiski sadaliet koniskajās mēģenēs vai burkās.

-Izgatavot 1X PBS no 10X rezerves šķīduma:

Veiciet atšķaidījumu 1:10. Piemēram, lai pagatavotu 1 litru 1X PBS, izmēra 100 ml rezerves šķīduma un pievieno 700 ml sterila destilēta ūdens. Pielāgo pH un piepilda ūdens daudzumu līdz 1000 ml.

Sagatavotais PBS buferšķīdums ir bezkrāsains un dzidrs.

Ikdienas PBS var uzglabāt istabas temperatūrā, bet pārējo - ledusskapī.

Risinājumi pH pielāgošanai

HCl

Par 100 ml 1 molārā HCL (sālsskābes).

Izmēra 91 ml destilēta ūdens un ievieto to 250 ml vārglāzē.

Izmēra 8,62 ml koncentrēta HCl un lēnām pievieno to vārglāzei, kurā ir ūdens (nekad nedari to otrādi). Rīkojoties ar stiprām skābēm (ļoti kodīgu vielu), veiciet atbilstošos bioloģiskās drošības pasākumus.

Sajauciet 5 minūtes, vēlams, izmantojot maisīšanas plāksni ar magnētisko stieni stikla iekšpusē. Transfer uz ml kolbā 100 un uzpilda līdz 100 ml ar destilētu H ₂ O.

NaOH

100 ml NaOH (nātrija hidroksīda) 10 mol.

Izmēra 40 ml destilēta ūdens un ievieto to 250 ml vārglāzē. Izmēra 40 g NaOH un pievieno ūdenim. Izmantojot maisīšanas plāksni, samaisiet ar magnētisko stieni stikla iekšpusē.

Pārnes 100 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar destilētu ūdeni. Ievērojiet bioloģiskās drošības noteikumus, jo šī reakcija ir eksotermiska (tā izdala enerģiju siltuma veidā).

Ja vēlaties pagatavot citu daudzumu fosfāta fizioloģiskā šķīduma, varat iepazīties ar šo tabulu:

Avots: «Vīrusu un cilvēka genomikas laboratorija, UASLP Medicīnas skola»

Lietojumprogrammas

To galvenokārt izmanto šūnu bioloģijā, imunoloģijā, imūnhistoķīmijā, bakterioloģijā, virusoloģijā un pētījumu laboratorijās.

Tas ir ideāli piemērots šūnu mazgāšanai ar centrifugēšanu (sarkano asins šūnu), šūnu vienslāņu mazgāšanu, spektroskopiskās elipsometrijas metodēs, baktēriju bioplēvju kvantitatīvā noteikšanā, šūnu kultūru uzturēšanā pret vīrusiem, kā mazgāšanas šķīdums netiešās imūnfluorescences tehnikā un monoklonālo antivielu raksturošanas paņēmienos.

To izmanto arī šūnu vai audu transportēšanai, kā atšķaidītāju šūnu skaitīšanai, šūnu enzīmu (tripsīna) sagatavošanai, kā biomolekulu žāvēšanas metodes atšķaidītāju un citu reaģentu sagatavošanai.

No otras puses, Martins un citi 2006. gadā parādīja, ka PBS ir noderīgs kriminālistikas laboratorijās, jo īpaši spermas atjaunošanā no maksts uztriepes vai maksts šūnu atjaunošanā no dzimumlocekļa uztriepes. Tādā veidā var noteikt, vai ir bijušas seksuālas attiecības.

Ierobežojumi

-Daži PBS buferi satur vielu, ko sauc par nātrija azīdu kā konservantu. Šis savienojums var radīt sprādzienbīstamas vielas, ja tas nonāk saskarē ar svinu vai varu. Šī iemesla dēļ, izmetot šo reaģentu kanalizācijā, ir jāievēro īpaša piesardzība. Ja to izmet šādā veidā, jāpievieno bagātīgs ūdens, lai to maksimāli atšķaidītu.

-Cinks nav jāpievieno fosfāta buferšķīdumam, jo ​​tas rada dažu sāļu izgulsnēšanos.

-Wangen et al., 2018. gadā tika noteikts, ka PBS lietošana nav piemērota primāru akūtas mieloleikozes (AML) šūnu mazgāšanai, kas iegūtas no perifērajām asinīm, sakarā ar to, ka daudzas šūnas tiek zaudētas līzes dēļ, ievērojami samazinoties materiālam. olbaltumvielas.

Tādēļ viņi noteica, ka primārās AML šūnas pēc mazgāšanas šķidrā slāpeklī nedrīkst mazgāt ar PBS.

Atsauces

1. Coll J. (1993). Diagnostikas paņēmieni virusoloģijā. Eds Diazs de Santoss. 360 lpp
2. Rodríguez M, Ortiz T. Šūnu kultūra. Vidēja maiņa. Seviļas Universitātes Normālās un patoloģiskās citoloģijas un histoloģijas katedra. Pieejams vietnē personal.us.es
3. Fosfātu buferšķīduma (PBS) sagatavošana. (2008). Standarta darbības procedūras (SOP) Cilvēka un vīrusu genomikas laboratorija UASLP Medicīnas skola. Pieejams vietnē: genomica.uaslp.mx
4. "Fosfātu buferšķīdums." Wikipedia, bezmaksas enciklopēdija. 2019. gada 3. aprīlis, 19:36 UTC. 2019. gada 13. aprīlis, 02:57 lv.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Molekulārās biofizikas tēmas. Pieejams vietnē: lietotāji.df.uba.ar
6. Rediar. Rokasgrāmata. PBS + EDTA. Pieejams vietnē: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Fosfātu buferšķīduma izmantošana šūnu un spermatozoīdu atjaunošanai no tamponiem. Sci tiesaistes. 2006; 46 (3): 179–84. Pieejams: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, et al. Saglabāšanas metode un fosfātu buferšķīduma mazgāšana ietekmē akūtas mieloīdo leikozes proteomu. Int. J Mol Sci. 2018. gads; 19 (1): 296. Pieejams: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Histoķīmijas teorētiskie un praktiskie pamati. Zinātnisko pētījumu augstākā padome. Madride. Pieejams vietnē books.google.co.ve