GRAMA TRAIPS: PAMATOJUMS, MATERIĀLI, TEHNIKA UN PIELIETOJUMS - BIOLOĢIJA - 2025

Grama krāsojums ir vienkāršākais un visvairāk noderīga krāsošanās tehnika diagnostikas mikrobioloģijā. Šo paņēmienu 1884. gadā izveidoja dāņu ārsts Hanss Kristians Grams, kuram saskaņā ar šūnas sienas sastāvu baktērijas izdevās klasificēt kā grampozitīvas un gramnegatīvas.

Šim paņēmienam Huckers 1921. gadā veica noteiktas modifikācijas, lai stabilizētu reaģentus un uzlabotu krāsošanas kvalitāti, tāpēc Gram traipu sauc arī par Gram-Hucker.

Dažādas uztriepes, kas iekrāsotas ar Gram traipu. A. Grampozitīvie kokči. B. gramnegatīvie stieņi. C. Grampozitīvas, polimorfonukleāras un mononukleāras baktērijas. D. Raugi.

Izmantojot šo paņēmienu, ir iespējams novērot arī mikroorganismu formu, tas ir, ja tie, cita starpā, ir kokči, baciļi, coccobacilli, pleomorfi, pavedienveidīgi. Kā arī tā izplatība telpā: klasterī, ķēdē, izolēti, pāros, tetrados utt.

Ja ir aizdomas par baktēriju infekciju, lielāko daļu saņemto paraugu vajadzētu nosmērēt uz priekšmetstikliņa un ar Gram iekrāsot mikroskopiskai izmeklēšanai.

Gram ziņojums ārstam palīdzēs noteikt, kāda veida mikroorganismi var būt infekcijas cēloņi, pirms tiek iegūts galīgais kultūras rezultāts.

Dažos gadījumos pacienta dzīve ir ļoti apdraudēta, tāpēc ārstiem steidzami nepieciešams Gram ziņojums, lai veiktu empīrisku ārstēšanu, kamēr viņi gaida mikroorganisma identificēšanu.

Piemēram, ja grams atklāj, ka cerebrospinālajā šķidrumā ir grampozitīvi kokiki, ārsts vadīs sākotnējo terapiju ar antibiotikām, kas iznīcina šāda veida baktērijas, saskaņā ar tam izstrādātajiem protokoliem.

Kad galarezultāts ir norādīts ar izolētā mikroorganisma nosaukumu un tā atbilstošo antiiogrammu, ārsts novērtē, vai mainīt terapiju. Šis lēmums tiks pieņemts saskaņā ar pētījumu par mikroorganismu jutīgumu pret saņemtajām antibiotikām un pacienta evolūciju.

Pamats

Šī ir tehnika, kurai ir 4 pamata darbības: krāsošana, fiksēšana ar kodinātāju, krāsas maiņa un krāsas nokrāsošana. Tāpēc šis paņēmiens papildus baktēriju krāsošanai ļauj tās arī diferencēt.

Kristālviolets ir pirmais izmantotais krāsviela. Tam ir afinitāte pret peptidoglikānu un tas nokrāso visas baktērijas purpursarkanā krāsā, pēc tam tiek ievietots lugols, kas darbojas kā kodinātājs, tas ir, tas inducēs šūnā nešķīstošu kristālvioletā-joda kompleksu - ribonukleāro olbaltumvielu veidošanos. .

Grampozitīvas baktērijas, kurām ir bieza peptidoglikāna siena, veido vairāk kompleksu (kristālvioletā joda), tāpēc tās saglabā krāsu.

Turklāt tas ietekmē arī to, ka grampozitīvo baktēriju sienā ir lielāks nepiesātināto skābju daudzums, kurām ir liela afinitāte pret oksidētājiem (Lugol).

Tikmēr gramnegatīvām baktērijām ir plāns peptidoglikāna slānis, kas baktērijām rada mazāk kompleksus nekā grampozitīvas.

Tad nāk krāsas maiņas solis, kurā grampozitīvās un gramnegatīvās baktērijas izturas atšķirīgi.

Gramnegatīvās baktērijas satur ārējo membrānu, kas bagāta ar lipopolisaharīdiem, kas ir daļa no viņu šūnu sienas. Taukus iznīcina, nonākot saskarē ar acetona spirtu, tāpēc ārējā membrāna destabilizējas, atbrīvojot violeto kristālu.

Tādā veidā tas tiek pretstatīts safranīnam vai pamata fuksīnam, kļūstot sarkanam.

Grampozitīvu baktēriju gadījumā tās pretojas izbalēšanai, jo balinātājs darbojas, aizverot poras, neļaujot kristālvioletā / joda kompleksam izplūst.

Tāpēc krāsa ar kristālvioletu paliek stabila, un tajā nav vietas safranīnam vai fuksīnam. Tāpēc šīs baktērijas iekrāsojas zilā vai purpursarkanā krāsā.

materiāli

Grama krāsošanas komplekts sastāv no:

• Violets stikls
• Lugols
• Acetona spirts
• Safranīns vai pamata fuksīns

Krāsvielu un reaģentu sagatavošana

Kristālvioletā šķīdums

Risinājums:

Violets kristāls ------------- 2 gr

Etilspirts 95% ----------- 20 ccc

B risinājums:

Amonija oksalāts ----------- 0,8 gr

Destilēts ūdens ------------- 80 cm3

Kristālvioletas galīgai pagatavošanai šķīdums A jāatšķaida ar 1:10 ar destilētu ūdeni un jāsajauc ar 4 daļām šķīduma B. Maisījumu pirms lietošanas uzglabā 24 stundas. Izmantojot filtrpapīru, filtrē dzintara krāsas pudelē.

Dienā lietojamais daudzums tiek pārskaitīts dzintara pilinātāja pudelē.

Jodo-Lugols

Nosver un izmēra norādīto katra savienojuma daudzumu šādi:

Joda kristāli ------------- 1gr

Kālija jodīds ------------- 2gr

Destilēts ūdens ------------- 300 cm3

Kālija jodīds pamazām izšķīst ūdenī un pēc tam pievieno jodu. Šķīdumu sakrata dzintara pudelē.

Dienā lietojamais daudzums tiek pārnests uz mazāku dzintara pudeli ar pilinātāju.

Balināšana

95% etilspirts -----------– 50 ml

Acetons ------------------ 50 ml

Tas ir sagatavots vienādās daļās. Pārklājiet labi, jo tam ir tendence iztvaikot.

Ievieto pilinātājā pudelē.

Šis preparāts nodrošina krāsas maiņu mērenā laikā 5–10 sekundes un ir visvairāk ieteicamais.

Iesācēji dod priekšroku tikai 95% etilspirta izmantošanai, ja izbalēšana notiek lēnāk par 10 līdz 30 sekundēm.

Lai arī pieredzējušāki var izmantot tīru acetonu, kur krāsas maiņa notiek ļoti ātri no 1 līdz 5 sekundēm.

Kontrasts

Safranīna krājumu risinājums

Safranina -------------– 2,5 gr

Etilspirts 95% --------– 100 kub

Pēc norādītā safranīna daudzuma nosvēršanas to izšķīdina 100 ml 95% etilspirta.

Darba safranīna šķīdumu sagatavo no rezerves šķīduma.

Lai to izdarītu, izmēra 10 cc rezerves šķīduma, pievieno 90 cc destilēta ūdens, lai iegūtu 100 ml.

Katru dienu lietojamo daudzumu ieteicams pārsūtīt dzintara pudelē ar pilinātāju.

Mikroorganismus, kuri ar Gram-Hucker traipu nokrāso vāji gramnegatīvus, piemēram, noteiktus anaerobus, Legionella sp, Campylobacter sp un Brucella sp, var daudz labāk iekrāsot, izmantojot Kopeloff Gram-Hucker traipa modifikācijas, ko sauc par Gram-Kopeloff traipu.

Šis paņēmiens maina safranīna krāsu uz pamata fuksīnu. Ar šo modifikāciju ir iespējams efektīvi krāsot iepriekš minētos mikroorganismus.

Reaģenta uzglabāšana

Sagatavotās krāsvielas jāuzglabā istabas temperatūrā.

Krāsainā parauga uztriepes sagatavošana

Pirms iespējama mikroorganismu novērošana uztriepē, paraugā jābūt vismaz 10 ⁵ mikroorganismiem. Uztriepes var izgatavot no tiešā parauga vai no kultūrām cietā vai šķidrā vidē.

Uztriepes jābūt vienmērīgām, labi sadalītām un ne pārāk biezām, lai labāk redzētu esošās struktūras.

-Graugs no tiešajiem paraugiem

Grams necentrificēta urīna

Urīnu sajauc un 10 μl ievieto priekšmetstikliņā. Vismaz vienas baktērijas / Dip lauka novērošana norāda uz infekcijas esamību.

Tas nozīmē, ka kultūra ir apmēram vairāk nekā 100,000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) urīna in 85% gadījumu.

Šī metode nav noderīga, ja koloniju skaits ir mazāks par 100 000 CFU.

CSF grams

CSF jācentrifugē, supernatants jānoņem un granulas jāizklāj uz priekšmetstikliņa. Šis šķidrums normālos apstākļos ir sterils; baktēriju novērošana norāda uz infekciju.

Elpošanas paraugu grami

Kaut arī krēpu, bronhu vai bronhoalveolārā skalošana Grama, lai arī var būt dažādi mikroorganismi, vienmēr vadīs diagnozi, turklāt tā būs noderīga novēroto šūnu veidam.

Krēpu gadījumā uztriepi jāsagatavo ar strutainākajām parauga porcijām.

Grams izkārnījumu

Nav ieteicams veikt gramu šāda veida paraugiem, jo ​​tam nav diagnostikas vērtības.

-Graudu graudi

Tos var izdarīt divos veidos: no šķidrajām kultūrām un otru no cietajām kultūrām.

Šķidrās kultūras

No šķidrajām kultūrām tas ir ārkārtīgi vienkāršs; Vairāki duļķainā buljona cepeši tiek ņemti zem degļa un novietoti uz tīra un sausa priekšmetstikliņa, veicot apļveida kustības no centra uz perifēriju, lai materiāls vienmērīgi sadalītos.

Ļaujiet tai spontāni izžūt gaisā. Kad materiāls ir nožuvis, ar karstumu to piestiprina loksnei. Lai to izdarītu, ar pinceti palīdzību loksni 3 līdz 4 reizes izlaiž caur Bunsena degļa liesmu, uzmanot, lai materiāls nededzinātu.

Loksnei ļauj atdzist un novieto uz krāsojošā tilta.

Cietās kultūras

Lai nosmērētu Gram traipu no cietas kultūras, rīkojieties šādi:

Pirms izvēlēties kolonijas, kuras jāuzņem, priekšmetstikliņš jāsagatavo, ievietojot apmēram divus pilienus sterila fizioloģiskā šķīduma.

Ja sākotnējā kultūras plate satur vairākus dažāda veida kolonijas, Gram veikšanai tiek izvēlēta izolēta katra kolonija. Katru koloniju ņems ar platīna cilpu, lai izšķīdinātu fizioloģiskajā šķīdumā, kas iepriekš tika ievietots priekšmetstikliņā.

Apļveida kustības tiek veiktas no centra virzienā uz perifēriju, lai vienmērīgi sadalītu koloniju priekšmetstikliņā.

Ļaujiet tai spontāni izžūt gaisā. Pēc žāvēšanas loksne tiek nostiprināta ar karstumu, kā paskaidrots iepriekš (ar liesmas uzliesmošanu ar šķiltavu), uzmanot, lai materiāls nededzinātu.

Šī procedūra jāveic ar katru dažādu koloniju veidu. Uz papīra jānorāda novērotā secība, piemēram:

1. kolonija: Beta-hemolītiskā dzeltenā kolonija: klasteros tika novēroti grampozitīvi kokiki

2. kolonija: Krēmkrāsas kolonija, bez hemolīzes: Novērotas gramnegatīvas coccobacilli.

Katrs slaids ir jāmarķē, lai zinātu, ko mēs novērojam.

Tehnika

Gram krāsošanas paņēmiens ir ārkārtīgi viegli izpildāms un salīdzinoši lēts, un to nevar palaist garām mikrobioloģijas laboratorijā.

To veic šādi:

1. Piestipriniet uztriepi ar karstumu un novietojiet uz krāsošanas tilta.
2. Objektīvu 1 minūti pilnībā pārklāj ar kristālvioletu.
3. Nomazgāt ar ūdeni Nežāvējiet
4. Pārklājiet lapu ar lugol šķīdumu un atstājiet iedarboties 1 minūti. Nomazgāt ar ūdeni Nežāvējiet.
5. Baliniet 5-10 sekundes, viegli sakratot spirta acetonā. Vai arī novietojiet lapu vertikālā stāvoklī un piliniet krāsas atkrāsotāja pilienus uz virsmas, līdz tiek noņemts pārpalikuma violetā stikla pārpalikums. Nepārsniedziet.
6. Nomazgāt ar ūdeni Nežāvējiet.
7. Nomainiet slaidu uz krāsošanas tilta un 30 sekundes pārklājiet ar safranīnu (Gram-Hucker) vai 1 min ar pamata fuksīnu (Gram-Kopeloff).
8. Nomazgājiet ar ūdeni
9. Ļaujiet tai spontāni nožūt vertikālā stāvoklī.

Pēc žāvēšanas ievietojiet 1 pilienu iegremdēšanas eļļas, lai gaismas mikroskopā novērotu to zem objekta 100X.

Lietderība

Šis paņēmiens ļauj atšķirt vairuma baktēriju morfotintorālās atšķirības.

Raugi izceļas arī ar šo krāsojumu. Viņi uzņem kristālvioletu, tas ir, viņi iekrāso grampozitīvu.

No otras puses, var atšķirt sporas veidojošos grampozitīvos baciļus, kuros baciļos, kur izveidojās endospora, tiek novērota brīva vieta, lai arī sporas labi nekrāsojas. Sporas krāsošanai tiek izmantotas citas metodes, piemēram, Shaeffer-Fulton.

Jāatzīmē, ka šo krāsošanu neizmanto visu veidu baktēriju krāsošanai, tas ir, ir gadījumi, kad krāsošana nedarbojas.

Šajā gadījumā var minēt baktērijas, kurām nav šūnu sienas. Piemēram: Mycoplasma ģints, sferoplasti, ureaplazmas, L formas un protoplasti.

Tas ļoti slikti krāso baktērijas ar sienām, kas bagātas ar mikola skābēm, piemēram, mikobaktērijām, un starpšūnu baktērijām, piemēram, Chlamydias un Rickettsias.

Tas nav efektīvs arī vairuma spirochetal baktēriju krāsošanā.

Ir vienas ģints baktērijas, kuras var novērot tajā pašā paraugā kā grampozitīvas un gramnegatīvas. Kad tas notiek, to sauc par mainīgu gramu traipu, kas var būt saistīts ar uzturvielu, temperatūras, pH vai elektrolītu koncentrācijas izmaiņām.

Izplatītas kļūdas

Pārspīlēta balināšana

Pārspīlējumi krāsas maiņas posmā var izraisīt viltus gramnegatīvu mikroorganismu novērošanu.

Nav jāgaida pietiekami ilgs žāvēšanas laiks, lai pievienotu iegremdēšanas eļļu

Tas var izraisīt grampozitīvas baktērijas iekrāsot gramnegatīvas (viltus gramnegatīvas). Tas notiek tāpēc, ka vecās kultūrās, iespējams, ir mirušas vai sabojātas baktērijas, un šajos apstākļos baktērijas neuztur kristālvioletu.

Izmantojiet ļoti veco lugol risinājumu:

Laika gaitā lugols zaudē savas īpašības un tā krāsa izbalē. Ja tiek izmantots jau deģenerēts reaģents, tas labi nenofiksēs violeti, tāpēc pastāv iespēja iegūt maldinošu gramnegatīvu mikroorganismu vizualizāciju.

Zils fons

Pareizi mainīts fons būs sarkans. Zils fons norāda, ka krāsas maiņa nebija pietiekama.

Atsauces

1. Raiens KJ, Rejs C. 2010. Šeriss. Medicīniskā mikrobioloģija, 6. izdevums McGraw-Hill, Ņujorka, ASV
2. Konemāns E, Allens S, Janda V, Šrekenbergers P, Vins W. (2004). Mikrobioloģiskā diagnostika. (5. izd.). Argentīna, Panamericana SA redakcija
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Beilija un Skota mikrobioloģiskā diagnostika. 12 ed. Argentīna. Redakcija Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Vispārīgā mikoloģija. Venecuēlas Centrālās universitātes 2. izdevums, bibliotēkas izdevumi. Venecuēlas Karakasa.
5. "Gram traipu." Wikipedia, bezmaksas enciklopēdija. 2018. gada 4. oktobris, 23:40 UTC. 2018. gada 9. decembris, 17:11. Ņemts no es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Medicīniskās mikrobioloģijas rokasgrāmata. 2. izdevums, Venecuēla: Karabobo universitātes plašsaziņas līdzekļu un publikāciju direktorāts.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Pamata traipi mikrobioloģijas laboratorijā. Pētījumi invaliditātes jomā. 2014. gads; 3 (1): 10-18.