DNS SEKVENCĒŠANA: MAXAM-GILBERT, METODE UN PIEMĒRI - BIOLOĢIJA - 2025

DNS secības (dezoksiribonukleīnskābes) ir procedūra, molekulārās bioloģijas laboratorijās, kas ļauj to zināt secību nukleotīdiem ģenētiskā materiāla interesi. Turklāt var atklāt arī RNS (ribonukleīnskābes) secību.

Šis paņēmiens ir bijis neaizstājams bioloģisko zinātņu attīstībā. Tas ir piemērojams arī citām zināšanu jomām, piemēram, piemēram, medicīniskajai diagnostikai un kriminālistikai.

Avots: pixabay.com

Iepriekš DNS virknes sekvencēšana tika uzskatīta par lēnu un dārgu darbību, kas ļāva oligonukleotīdos identificēt tikai dažus bāzes pārus.

Mūsdienās, pateicoties visiem zinātnes sasniegumiem, DNS sekvencēšana ir ikdienas darbība daudzās laboratorijās visā pasaulē, pateicoties gandrīz 50 gadu ilgam pētījumu ieguldījumam šajā jomā. Ķēdes garuma ziņā ļoti īsā laikā var secēt līdz miljoniem bāzes pāru.

Lai to izdarītu, ir izstrādāti desmitiem paņēmienu, kuru cena un precizitāte atšķiras. Šajā rakstā mēs aprakstīsim gan klasiskās, gan modernās tehnikas, katra ar savām priekšrocībām un trūkumiem.

Līdz šim sekvencēšanas paņēmieni ļauj iegūt pilnīgu genomu secību, sākot no maziem prokariotiem un raugiem līdz cilvēka genomam.

DNS struktūra

Lai saprastu metodes un paņēmienus, ko izmanto DNS secēšanai, ir jāzina noteikti galvenie molekulas struktūras un sastāva aspekti.

DNS ir biomolekula, kas atrodama visās dzīvajās lietās, sākot no baktērijām un beidzot ar lieliem ūdensdzīvniekiem. Organelliem - tāpat kā mitohondrijiem un hloroplastiem - tajos ir apaļa DNS molekula. Pat dažos vīrusos atrastais ģenētiskais materiāls ir DNS.

Strukturāli DNS ir nukleotīdu kolekcija. Katru no tiem veido ogļhidrāti, slāpekļa bāze (A, T, C vai G) un fosfātu grupa. DNS secības noteikšanas mērķis ir atklāt secību, kādā secībā tiek atrastas četras slāpekļa bāzes.

Vēsture

50. gadu vidū pētnieki Vatsons un Kriks aprakstīja DNS struktūru, izmantojot kristoloģiskās metodes. Tomēr neviens no šiem pētniekiem nebija spējis atrast veidu, kā atšifrēt secību.

Lai arī bija daži priekšgājēji, vissvarīgākais notikums bija Sangera metodes izveidošana 1977. gadā. Metodes tēvs Frederiks Sangers bija britu bioķīmiķis, divu Nobela prēmiju ieguvējs par milzīgo ieguldījumu bioloģiskajās zinātnēs.

Šī metode literatūrā ir pazīstama arī kā "ķēdes izbeigšana" vai dideoksinukleotīdi. Tālāk tiks aprakstīti šīs tehnikas principi un principi, kas tika izstrādāti, pamatojoties uz tā uzlabošanu un inovācijām.

Sangera metode

Sangera metodes attīstība bija būtisks notikums molekulārajā bioloģijā. Tas ietver DNS replikācijas procesa pamatkomponentus, kas parasti notiek šūnā, bet pievienojot īpašu komponentu: dideoksinukleotīdus.

Galvenās reakcijas sastāvdaļas

- DNS polimerāze: DNS polimerāzes enzīms ir būtisks procesa elements. Šī molekula piedalās DNS virknes replikācijā, un tās loma ir jaunās virknes sintēze, savienojot pārī trifosfāta dezoksiribonukleotīdus ar papildinošajiem.

Atgādiniet, ka DNS, timīni (T) savienojas ar adenīniem (A) caur divām ūdeņraža saitēm, bet citozīns (C) to dara ar guanīnu (G) caur trim saitēm.

- Nukleotīdi: Sangera sekvencē ietilpst divu veidu nukleotīdi: četri 2'-dezoksinukleotīdi (saīsināti kā dATP, dGTP, dCTP un dTTP) un četri didezoksinukleotīdi (ddATP, ddGTP, ddCTP un ddTTP).

Lai arī dideoksinukleotīdi ir līdzīgi monomēriem, kas parasti tiek iekļauti DNS, to struktūrā nav -OH grupas. Tas padara neiespējamu jaunu nukleotīda pievienošanu ķēdei.

Tāpēc, kad veidošanās ķēdei tiek pievienots īpašs nukleotīds - pilnīgi nejaušā veidā -, sintēze tiek paralizēta. Tādējādi reakcijas beigās ir dažāda lieluma ķēdes, katrā no tām, kur reakcija tika apturēta citā vietā.

Eksperimentāli tiek sagatavoti četri testi. Katrā no tām ir iegūta DNS, kas iegūta no interesējošā bioloģiskā parauga, parastie nukleotīdi un viens no četriem īpašajiem nukleotīdu veidiem. Īpašos nukleotīdus apzīmē ar kāda veida fluorescējošiem marķieriem (sk. Zemāk esošo automātisko secību).

Rezultātu nolasīšana

Pirmais solis ir atdalīt katru sintezēto ķēdi pēc to lieluma. Daži no tiem būs garāki nekā citi atkarībā no tā, kur tika iestrādātas īpašās bāzes.

Pastāv dažādas bioķīmiskās metodes, kas ļauj atdalīt maisījuma sastāvdaļas, izmantojot izmēru kā diskriminējošu īpašību. Pēc Sangera metodes dažādas ķēdes atdala ar elektroforēzi. Sarežģītākos tehnikas variantos tiek izmantota kapilārā elektroforēze.

Tādējādi garākie virzieni pārvietojas mazāk nekā īsāki varianti. Pēc tam šī sistēma iet caur lasītāju, kas atpazīst marķieri, kas iekļauts katrā dideoksinukleotīdā. Tādā veidā var uzzināt secības secību.

Šī "pirmās paaudzes" metode spēj nolasīt DNS fragmentus, kas nav lielāki par 1 kilobāzi. Pašlaik Sangera metodi izmanto dažādās laboratorijās, parasti tās mūsdienu variantos. Turklāt to izmanto, lai apstiprinātu rezultātus, kas iegūti ar vissarežģītākajām metodēm - bet mazāk precīzi.

Automātiska secība

Ja sekvencēšana ir nepieciešama lielā mērogā, process tiek paātrināts, izmantojot automatizāciju. Šī ir Sangera ķēdes izbeigšanas metodes variācija, kad gruntskrāsas tiek marķētas ar dienasgaismas produktiem, lai tos varētu atšķirt.

Pēc tam reakcijas produktu vada elektroforēzes veidā - visi uz vienas joslas. Kad katrs fragments iziet no pēdējās gēla daļas, to ātri identificē ar fluorescējošo marķējumu ar kļūdu ap 1%.

Sarežģītākajās sistēmās ir sistēma līdz 96 kapilāru caurulēm, kuras pārvalda dators, kas savienots ar robotu. Tas ir, 96 DNS paraugus var pārbaudīt vienlaikus. Tādējādi process, kas saistīts ar elektroforēzi un rezultātu analīzi, ir pilnībā automatizēts.

Vienā dienā šīs sistēmas var secīgi sakārtot līdz 550 000 bāzēm. Procesa laikā cilvēku darbs nav vajadzīgs, un metodes iedarbināšana prasa tikai apmēram 15 minūtes.

Maksima-Gilberta secība

Tajā pašā laikā, kad Sangers publicēja savu darbu, diviem pētniekiem ar nosaukumu Allan Maxan un Walter Gilbert izdevās izstrādāt citu metodi DNS sekvences iegūšanai. Metode tolaik ieguva popularitāti, bet vēlāk to nomainīja, uzlabojot Sangera metodi.

Pretēji Sangera metodei Maksana un Gilberta sekvencēšana (vai ķīmiskā secība, kā tas arī ir zināms) neietver hibridizācijas reakcijas. Metodika sastāv no marķēšanas ar reaktīviem līdzekļiem vienā galā, kam seko attīrīšanas process.

Viens no šīs tehnikas negatīvajiem aspektiem ir tā milzīgā sarežģītība un lietotājam bīstamo ķīmisko vielu lietošana. Ķīmiskus pārtraukumus izraisa DMS, skudrskābes, hidrazīna un hidrazīna pievienošana ar sāļiem.

Process

Protokols sākas ar marķēšanu šķipsnas 5 'galā ar fosfora marķieri 32, pēc tam notiek slāpekļa bāzes ķīmiska modifikācija un tā tiek atdalīta. Visbeidzot, notiek abasiskā reģiona šķelšanās.

Vispirms saīsiniet virkni, kuru vēlaties secīgi sadalīt mazākos segmentos. Šis solis tiek veikts ar restrikcijas fermentiem, kā rezultātā tiek izvirzīti gali.

Pēc tam reakciju veic ar sārmainu fosfatāzi, kuras mērķis ir izvadīt fosfātu grupu. Tādējādi marķēšanai var izmantot polinukleotīdu kināzi.

Ķēde ir denaturēta (abas šķipsnas ir atvērtas). Tad ķimikālijas tiek uzklātas. Šīs šķelšanās reakcijas tiek veiktas kontrolētā veidā, un ir zināms, kāda veida saites sabojājas katra izmantotā ķīmiskā viela.

Rezultātu nolasīšana

Tāpat kā Sangera metodē, rezultātu nolasīšana ietver elektroforēzes sistēmā iegūto ķēžu atdalīšanu pēc lieluma. Sistēmas, kas sastāv no poliakrilamīda, ļauj iegūt ļoti labu izšķirtspēju želejas lasīšanai.

Masu secība

Masveida sekvencēšana ietver jaunu metožu sēriju, saīsināti NGS, no angļu valodas “Next Generation Sequencing”.

Metodes, kas klasificētas kā NGS, prasa iepriekšēju DNS amplifikācijas posmu (tās nedarbojas ar vienu molekulu). Turklāt izmantotās platformas ir ļoti dažādas. Tālāk tiks aprakstīti populārāko metožu principi:

Pirosequencing

Tas ietver pirofosfāta izdalīšanās uzraudzību, kas notiek katru reizi, kad DNS virknei pievieno jaunu nukleotīdu. Fermentu sistēma ir savienota tā, ka gaismas izstarošana (ko var noteikt ar kameru) notiek katru reizi, kad tiek iestrādāts jauns nukleotīds.

Process sākas ar katras slāpekļa bāzes atsevišķu inkubāciju, lai pārbaudītu, vai pastāv gaismas emisija. Pirozequencing var nolasīt garu virkni, bet atrasto kļūdu līmenis ir augsts.

Sintēzes secība

Tas ietver marķētu nukleotīdu iekļaušanu. Šos fluorescējošos komponentus pievieno, mazgā un atzīmē pievienoto nukleotīdu. Pēc tam nukleotīda etiķete tiek noņemta, un šķipsnas sintēze var turpināties. Nākamajā posmā tiks iekļauts arī marķēts nukleotīds, un iepriekšminētās darbības tiks atkārtotas.

Šīs tehnikas trūkums rodas, ja dienasgaismas marķieri nav pilnībā noņemti. Šīs emisijas rada fona kļūdas, kā rezultātā rodas būtiskas kļūdas.

Ligācijas secība

Šis paņēmiens atšķiras no citiem, jo ​​tajā netiek izmantota DNS polimerāze. Tā vietā šīs metodes galvenais enzīms ir ligase. Šeit tiek izmantoti ar fluorescenci iezīmēti DNS fragmenti, tos savieno enzīms un tas tiek noteikts.

Šīs tehnikas lielākā problēma ir īsais fragmenta garums, kuru tas spēj apstrādāt.

Jonu torrentu secība

Šīs tehnikas pamatā ir H ⁺ jonu mērīšana, kas izdalās katru reizi, kad tiek iestrādāts jauns nukleotīds. Princips ir diezgan līdzīgs pirosequencing, bet daudz lētāks.

Piemēri

Cilvēka genoma sekvencēšana

Cilvēka genoma secēšana ir bijusi viena no daudzsološākajām pārbaudēm bioloģijā, kā arī viena no atzītākajām sāncensībām zinātnes vēsturē. Faktiski projektā iesaistītajiem zinātniekiem genoma secēšana kļuva par konkurenci.

1990. gadā viņš uzsāka tā saukto "cilvēka genoma projektu", kuru vadīja slavenais zinātnieks, Nobela prēmijas laureāts Džeimss Vatsons. Pēc gada, 1991. gadā, Venters pieņem izaicinājumu "piekaut" Vatsonu un sekvenēt viņa priekšā esošo genomu. Tomēr 1992. gadā Vatsons aizgāja pensijā, un komandu paņēma cits pētnieks.

1995. gadā Venters paziņoja par saviem panākumiem baktēriju genoma pilnīgā sekvencēšanā, izmantojot nejaušās secības metodi. Līdzīgi pretinieku komanda gadu vēlāk paziņoja par rauga genoma secību.

2000. gadā grāds tika izbeigts. Abas kompānijas publicēja provizoriskos visa genoma rezultātus divos zinātnes prestižākajos žurnālos: Daba un Zinātne.

Tomēr zinātnieki turpināja darbu pie priekšlikumu uzlabošanas, un 2006. gadā tika pabeigtas noteiktu cilvēka hromosomu secības.

Svarīgums un lietojumi

Zinot tik svarīgas molekulas kā DNS nukleotīdu secību, biologiem un radniecīgiem speciālistiem tas ir vērtīgi. Šajā polinukleotīdu ķēdē ir visa informācija, kas nepieciešama visu dzīves veidu attīstībai un uzturēšanai.

Šo iemeslu dēļ zināšanas par šo secību ir būtiskas bioloģiskajiem pētījumiem. Principā secība ļauj izmērīt vienu no svarīgākajām bioloģisko sistēmu īpašībām un noteikt atšķirības starp tām.

Sekvencēšanu plaši izmanto taksonomisti un sistemātisti, jo noteiktas DNS sekvences ļauj noteikt kritērijus, lai secinātu, vai divi organismi pieder vienai un tai pašai sugai, turklāt tie var piedāvāt hipotēzes par to filoģenētiskajām attiecībām.

Turklāt DNS secību var pielietot medicīnā un diagnostikā. Piemēram, ir lētas un pieejamas sistēmas, kas, izmantojot sekvencēšanu, ļauj novērtēt tendenci attīstīt noteiktas slimības (piemēram, vēzi), izmantojot tā sauktos viena nukleotīda polimorfismus (SNP).

Arī kriminālās un kriminālistikas izmeklēšana ir bagātināta ar secības paņēmieniem, kurus var izmantot kā ticamus pierādījumus par noteiktas personas dalību noziegumā.

Atsauces

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Sekvenieru secība: DNS sekvencēšanas vēsture. Genomika, 107. panta 1. punkts, 1. – 8.
2. Koboldt, DC, Šteinberga, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Nākamās paaudzes sekvencēšanas revolūcija un tās ietekme uz genomiku. Šūna, 155 (1), 27.-38.
3. Levijs, J. (2010). Zinātniskā konkurence. No Galileo līdz cilvēka genoma projektam. Redakcijas Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). DNS sekvencēšana ar ķēdi izbeidzošiem inhibitoriem. Nacionālās zinātņu akadēmijas raksti, 74 (12), 5463-5467.
5. Šusters, SC (2007). Nākamās paaudzes secība pārveido mūsdienu bioloģiju. Dabas metodes, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Red.). (2014). Nākamās paaudzes secība. Caister Academic Press.