OKSIDĀZES PĀRBAUDE: PAMATOJUMS, PROCEDŪRA UN LIETOJUMS - BIOLOĢIJA - 2025

Oksidāzes tests ir diagnostikas metode, kas parāda klātbūtne fermentu kompleksu sauc citohroma oksidāzes c. Šī sistēma izraisa citohroma pārveidi, kas samazināta līdz oksidētai, jo tā uztver skābekli, un tas, savukārt, darbojas kā pēdējais elektronu akceptors (H ⁺ ) elpošanas ķēdē.

Termins oksidāze ir saīsināts veids, kā atsaukties uz enzīmu citohroma oksidāzi, kas pazīstams arī kā indofenola oksidāze. Senatnē tika uzskatīts, ka fermenti citohroma oksidāze un indofenola oksidāze ir divi dažādi fermenti, taču šodien ir zināms, ka tie ir vienādi.

Pozitīvs un negatīvs oksidāzes tests. Avots: nav sniegts mašīnlasāms autors. Alpha.prim ~ commonswiki pieņemts (pamatojoties uz autortiesību pretenzijām).

No savas puses citohromi ir hemoproteīni, kas satur dzelzi un pabeidz citohroma oksidāzes sistēmu. Citohromi dažādās sugās var atšķirties.

Ir dažādas citohromu šķirnes (citohromi a1, a2, a3 un 0). Dažas baktērijas var ražot tikai vienu, bet citas - ne vairāk kā divus vai trīs vienlaikus. Šajā nozīmē citohroma a un a3 klātbūtne ir zināma kā citohroma oksidāze c. Tas ir citohroma tips, ko nosaka oksidāzes tests.

Ģints Neisseria un Pseudomonas satur citohroma oksidāzi c. Šīs ģints dod pozitīvu oksidāzes testu, palīdzot tās atšķirt attiecīgi no Acinetobacter un Stenotrophomonas ģintīm.

Ir arī citas ģints, kurām ir pozitīva oksidāze.

Pamats

Citohroma oksidāzes c sistēmas raksturojums

Citohroma oksidāzes c sistēma darbojas šādā veidā: oksidāzes pozitīvi mikroorganismi izmanto skābekli, lai ģenerētu enerģiju ar aerobo elpošanu. Šī sistēma darbojas, pateicoties elektronu transportēšanai no donorvielām, piemēram, NADH ^+, uz receptoru vielām, šajā gadījumā skābekli.

Tā rezultātā tiek ražota enerģija (ATP) un ūdens vai ūdeņraža peroksīds, atkarībā no citohroma oksidāzes sistēmas, kas piemīt mikroorganismam.

Tāpēc lielākajai daļai oksidāzes pozitīvo baktēriju ir arī katalāzes pozitīvi, kas ir nepieciešams nosacījums radītā ūdeņraža peroksīda izvadīšanai, jo šī viela ir toksiska baktērijām.

Citohroma oksidāzes c sistēma atrodas dažās aerobās baktērijās, dažās fakultatīvās anaerobās, nedaudzās mikroaerofilās baktērijās un nav stingru anaerobu. Pēdējais ir saprotams, jo stingri anaerobi nevar dzīvot skābekļa klātbūtnē, tāpēc viņiem trūkst citohroma oksidāzes sistēmas.

Pārbaudes princips

Šajā testā tas izmanto vielas, kas darbojas kā mākslīgie elektronu akceptori, aizstājot dabiskos elektronu transportēšanas ķēdē.

Galvenokārt tiek izmantotas tādas krāsvielas kā parafenēndiamīns un indofenols, kas darbojas kā receptoru substrāti un mākslīgie elektronu donori.

Pafenilēndiamīns tiek oksidēts ar citohroma oksidāzes c sistēmu. Krāsviela samazinātajā formā ir bezkrāsaina, bet oksidētā formā - krāsaina.

Tādējādi tiek pierādīta citohroma oksidāzes c sistēmas klātbūtne; jo pozitīva reakcija atkarībā no izmantotā reaģenta rada lavandu vai zili violetu krāsu.

No otras puses, ja pēdējā elektronu pieņemošā viela elpošanas ķēdē atšķiras no skābekļa, oksidāzes tests būs negatīvs (nav krāsu veidošanās); tas attiecas uz anaerobiem mikroorganismiem.

Tāpat, ja citohroms, ko izmanto mikroorganisms, atšķiras no citohroma oksidāzes c, tas arī sniegs negatīvu testu.

Process

Oksidāzes testam ir dažādi reaģenti un protokoli, visi tie paši.

Reaģenti

Kovacs reaģents, Gordona un McLeod reaģents, Nadi reaģents, Carpenter, Suhrland un Morrison reaģents un oksidāzes disku izmantošana.

-Kovacs oksidāzes reaģents

To veido 1% tetrametil-p-fenilēndiamīna dihidrohlorīds.

Kovacs reaģentu sagatavo, izšķīdinot 1 g iepriekšminētās vielas 50 ml destilēta ūdens. To smalki karsē, līdz tas pilnībā izšķīst. Pārnes pietiekamā tilpumā dzintara krāsas pudelē un ar destilētu ūdeni uzpilda līdz 100 ml. Pirms lietošanas pagaidiet vismaz 15 minūtes. Uzglabāt ledusskapī, kas pasargāts no gaismas.

Tas ir marķēts ar Kovacs oksidāzes reaģentu, lai to atšķirtu no Kovacs reaģenta, ko izmanto indola testa atklāšanai. Šis reaģents ir visjutīgākais, mazāk toksisks, bet dārgāks nekā pārējie reaģenti.

Pozitīva reakcija tiks parādīta ar šo reaģentu, kolonijai mainoties krāsai uz lavandu, kas ātri kļūst violeta gandrīz melna. Negatīva reakcija ir acīmredzama, jo kolonijā nav krāsas maiņas vai tā iegūst nelielu sārtu krāsu. Barotne var arī satumst, bet tas nenozīmē pozitīvu reakciju.

Izmantojot šo reaģentu, reakcijas laiks ir izšķirošs, krāsas maiņa, kas notiek no 5 līdz 15 sekundēm, tiek uzskatīta par pozitīvu reakciju.

-Gordona un Makleoda reaģents

Tas sastāv no dimetil-p-fenilēndiamīna dihidrohlorīda, kas pazīstams arī kā N-dimetil-p-fenilēndiamīns vai p-aminodimetilalanilīna monohidrohlorīds. To sagatavo, kā aprakstīts Kovacs oksidāzes reaģentam, aizstājot iesaistīto vielu.

Šis reaģents ir nedaudz stabilāks nekā Kovacs oksidāzes reaģents, lai gan visi reaģenti, kas satur p-fenilēndiamīnu, ir nestabili.

Šī reakcija ir vēlāka, un to interpretē kā pozitīvu ar zili violetas krāsas parādīšanos 10 līdz 30 minūšu laikā.

-Nadi reaģents

Tas sastāv no 1% α-naftola etilspirtā (95% etanola) un 1% aminodimetilalanilīna. Maisījumu sagatavo vienādās daļās un kā atšķaidītāju izmanto absolūto etilspirtu, līdz tiek piepildīts pietiekams daudzums 100 ml.

-Karteris, Suhrland un Morrison reaģents

Tas sastāv no 1% p-aminodimetilalanīna oksalāta. Pagatavo tāpat, kā aprakstīts Kovacs oksidāzes reaģentam, mainot to uz atbilstošo vielu.

Kad šķīdums ir gatavs, testa strēmeles sagatavo šādi: 6-8 cm Whatman Nr. 1 filtrpapīra sloksnes ir piesūcinātas ar 1% dimetil-p-fenilēndiamīna oksalāta reaģentu.

Viņiem ļauj nožūt bez saskares ar metālu, uzglabāt aizskrūvētajās burkās ar žāvēšanas līdzekli un uzglabāt ledusskapī. Šīs sloksnes ir stabilas līdz 6 mēnešiem.

Tas ir visstabilākais reaģents no visiem iepriekšminētajiem, un šķīdumā var saglabāties līdz 6 mēnešiem. Vēl viens plus punkts ir tas, ka tas nekrāso barotni ap koloniju, ja to lieto tieši uz šķīvja.

Sarkanas krāsas izskats tiek interpretēts kā pozitīvs tests.

-Oksidāzes diski

Tie ir komerciāli diski, kas piesūcināti ar reaģentu oksidāzes testam. Tirgū ir vairāki komerciāli zīmoli.

Tās izmantošana ir diezgan praktiska, jo nav nepieciešams sagatavot svaigus reaģentus, kas atvieglo darbu. Iegūtie rezultāti ir ticami, kamēr diski tiek pareizi saglabāti.

Protokoli

Tiešā plāksnes metode, netiešā metode uz papīra un disku izmantošana, kas piesūcināti ar oksidāzes reaģentiem.

-Tiešā dēļa metode

Šim nolūkam tieši uz koloniju (-ām), kas atrodas kultūras barotnes plāksnē, kas nesatur glikozi, pievieno 2 vai 3 pilienus jebkura no iepriekšminētajiem reaģentiem.

Interpretē koloniju krāsas maiņu vai nē, nevis barotni. Derīgais reakcijas laiks ir atkarīgs no izmantotā reaģenta.

-Tieša metode uz papīra

Izgrieziet filtra papīra gabalu (Whatman Nr. 1) 6 cm ² lielumā un ievietojiet to tukšajā Petri traukā.

Pievienojiet papīram 2 vai 3 pilienus Kovacs oksidāzes reaģenta, ņemiet daļu pētāmās kolonijas ar rokturi ar platīna rokturi vai koka zobu bakstāmo un taisnā līnijā izklājiet to ar reaģentu piesūcinātu papīru. Interpretējiet 5 līdz 10 sekunžu laikā.

Ar sloksnēm, kas sagatavotas ar Carpenter, Suhrland un Morrison reaģentu, koloniju izklāj uz sausas sloksnes. Lai pārbaudītu vairākus celmus, tiek izmantota viena sloksne. Interpretēt pēc 10 sekundēm

-Diski (m

Smalki samitriniet komerciālos diskus ar sterilu destilētu ūdeni un uzklājiet uz pētāmās kolonijas. Plātnes ieteicams izmantot 35 ° C temperatūrā, ja tiek izmantotas plātnes istabas temperatūrā vai atdzesētas plātnes, reakcija ir nedaudz lēnāka. Interpretējiet krāsu maiņu no 10 līdz 20 sekundēm.

Var izmantot kolonijas, kas atrodas uz asinīm vai šokolādes agara.

-Diski (netiešā metode)

Samitriniet disku, kā aprakstīts iepriekš. Ievietojiet to tukšā Petri traukā. Paņemiet pietiekamu daudzumu kolonijas, lai izpētītu ar platīna rokturi vai koka zobu bakstāmais, un novietojiet to uz diska. Interpretējiet krāsu maiņu no 10 līdz 20 sekundēm.

Izmantojiet

Neisseria ģints un Acinetobacter ģints morfoloģiski dažreiz ir ļoti līdzīgas, jo, kaut arī Acinetobacter ģints ir gramnegatīvs stienis, dažreiz tas var būt kokosriekstu formā un sadalīties pa pāriem, imitējot Neisseria ģints.

Šajā gadījumā oksidāzes tests ir patiešām noderīgs. Neisseria ģints ir pozitīva un Acinetobacter negatīva.

Tomēr Moraxella ģints ir ļoti līdzīga Neisseria ģintij, un tās abas rada pozitīvu reakciju; Tāpēc galīgai identifikācijai vienmēr jāveic ogļhidrātu fermentācijas testi.

No otras puses, oksidāzes tests ir noderīgs, lai atšķirtu baktēriju, kas pieder Enterobacteriaceae ģimenei (visām oksidāzes negatīvajām) no citiem fermentoriem, piemēram, Pasteurella ģints, Aeromonas, Plesiomonas (pozitīvas oksidāzes).

Arī Vibrio un Helicobacter ģints ir pozitīvas oksidāzes.

QA

Izmantojiet zināmos Escherichia coli celmus kā negatīvo kontroli un Pseudomonas aeruginosa celmus kā pozitīvo kontroli.

Ierobežojumi

-Reaģenti jāizmanto svaigi pagatavoti, to glabāšanas laiks šķīdumā istabas temperatūrā ir īss, jo tie ir ļoti nestabili. Atdzesēti tie var ilgt no 5 dienām līdz 2 nedēļām.

-Reaģenti ir bezkrāsaini, ja, mainot krāsu, tie jāiznīcina. Bojāti diski parādās, jo laika gaitā tie kļūst tumšāki.

-Pozitīva reakcija ar Kovacs oksidāzes reaģentu laika posmā no 15 līdz 60 sekundēm tiek uzskatīta par aizkavētu reakciju, un pēc 60 sekundēm tā jāuzskata par negatīvu.

-Haemophylus influenzae rada negatīvu oksidāzes reakciju, ja tiek izmantots jebkurš reaģents ar dimetil-p-fenilēndiamīnu, bet pozitīvs, ja tiek izmantots Kovacs oksidāzes reaģents (tetrametil-p-fenilēndiamīns).

-Mediāji, kas satur glikozi, traucē testu, dodot nepatiesas negatīvas.

-Bordetella pertussis celmi var izraisīt nepatiesu pozitīvu reakciju, ja tie nāk no ļoti koncentrētām asins agara plāksnēm.

- Metāla (dzelzs) rokturu izmantošana rada nepatiesu pozitīvu reakciju.

ieteikumi

- Tā kā reaģenti ir ļoti nestabili un mēdz pašoksidēties, ieteicams iesaldēt 1 līdz 2 ml alikvotas un pēc vajadzības noņemt.

-Cits veids, kā aizkavēt reaģenta automātisko oksidēšanu, ir, reaģentu gatavošanā, pievienojot 0,1% askorbīnskābes.

- Tā kā reaģenti ir nestabili, ieteicams veikt iknedēļas kvalitātes kontroli.

-Regenti, kas neiztur kvalitātes kontroles testu, nav jāizmanto.

Atsauces

1. Konemāns E, Allens S, Janda V, Šrekenbergers P, Vins W. (2004). Mikrobioloģiskā diagnostika. 5. ed. Redakcija Panamericana SA Argentīna.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Beilija un Skota mikrobioloģiskā diagnostika. 12 ed. Redakcija Panamericana SA Argentīna.
3. "Oksidāzes tests." Wikipedia, bezmaksas enciklopēdija. 2018. gada 15. janvāris, 10:32 UTC. 2019. gada 3. aprīlis, 14:03
4. Pasaules Veselības organizācija. Laboratorijas rokasgrāmata sabiedrības veselības nozīmes baktēriju patogēnu antibakteriālas jutības noteikšanai un pārbaudei jaunattīstības valstīs, 2004. gads. Pieejams vietnē: who.int/drugresistance/infosharing
5. Reaģenta sloksnes baktēriju oksidāzes aktivitātes diagnosticēšanai. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150–151.