K PROTEINĀZES: ĪPAŠĪBAS, FERMENTATĪVĀ AKTIVITĀTE, PIELIETOJUMI - BIOLOĢIJA - 2025

K proteināzi ir ferments, kas pieder grupai, serīna proteāzes, ti, tas ir tās vidējā katalītiski aktīva aminoskābe serīna un ir funkcija sadalīšana peptīdu saites ar hidrolīzi. Šis ferments savukārt pieder subtilisīna olbaltumvielu (peptidāze S8) saimei.

Proteināzes K molekulmasa (MW) ir 28 900 daltonu, un tā pirmo reizi tika izolēta 1974. gadā Engyodontium albuma sēnītes, iepriekš zināmas kā Tritirachium album Limber, ekstraktos.

Proteināzes K. molekulārā struktūra Avots: Lykchiniadis

Tam piemīt augsta proteolītiskā spēja, ko pierāda spēja noārdīt matos esošo keratīnu. Vārds keratīns angļu valodā ir uzrakstīts kā "keratīns", tāpēc to sauca par "proteināzi K".

Sakarā ar lielo spēju sadalīt dabiskos proteīnus, šis ferments ir noderīgs dažādās molekulārās bioloģijas metodēs. To galvenokārt izmanto lielmolekulāro (MW) nukleīnskābju izolēšanai un sagatavošanai.

Proteināze K darbojas, atbrīvojot kodola DNS, vienlaikus iznīcinot olbaltumvielas un inaktivējot RNāzes un DNāzes, tas ir, tā novērš nukleāzes DNS un RNS preparātos.

No otras puses, ir redzams, ka proteināze K var hidrolizēt dažus denaturētus dabiskos proteīnus, kas ir izraisījis pētnieku interesi par tā izmantošanu prionu olbaltumvielu (PrPC) izpētē.

Tomēr, neraugoties uz augsto proteolītisko potenciālu, ir olbaltumvielas, kas ir izturīgas pret proteināzes K. darbību. Starp tām ir dažas patoloģiskas olbaltumvielas, ko sauc par prioniem (PrPSc), kas saistītas ar transmisīvajām sūkļveida encefalopātijām.

Proteināzes K īpašības

Proteināzei K ir terciārā struktūra, kas sastāv no trim slāņiem, ar septiņu ķēžu β loksni, kas izvietota starp diviem helices slāņiem. Tā kā tas pieder S8 peptidāžu saimei, to raksturo tas, ka aktīvajā vietā ir katalītiskā triāde, kuras secīgā secība ir (Asp, His un Ser), kas tos atšķir no citām peptidāžu ģimenēm.

Šo ferīnu no serīna proteāžu grupas raksturo peptīdu saišu hidrolizēšana tuvu alifātisko un aromātisko aminoskābju karboksilgrupai.

No otras puses, tas spēj darboties noteiktu kodīgu vielu klātbūtnē, piemēram, nātrija dodecilsulfāts (SDS), Tris-HCL un EDTA, kuras tiek izmantotas olbaltumvielu denaturēšanai, izraisot to dabiskās struktūras zaudēšanu.

Šis ir sākotnējs solis olbaltumvielu sagatavošanā elektroforēzes tehnikai. PH diapazons, kurā darbojas proteināze K, ir diezgan plašs (no 2,0 līdz 12,0), optimālais pH ir no 7,5 līdz 12,0, un tā izoelektriskais punkts ir 8,9. Kā redzams, tas ir aktīvs pret ļoti plašu pH diapazonu.

Vēl viena īpašība, kas izceļas proteināzē K, ir tās stabilitāte augstā temperatūrā (50–60 ° C).

Fermentatīva darbība

K proteināzei K nepieciešama kalcija jona klātbūtne, lai gan tas neietekmē tā darbību, ja tas ir svarīgi, lai saglabātu tā stabilitāti.

Lai proteināze K pilnībā sagremotu substrātu, nepieciešams aptuveni 5 minūšu līdz 2 stundu ilgs kontakta laiks.

Tomēr šajā ziņā Daza et al. Salīdzināja iegūtā DNS tīrību dažādos iedarbības periodos ar proteināzi K un secināja, ka ilgstoša inkubācija (līdz 24 stundām) ievērojami uzlabo DNS kvalitāti.

Tomēr attiecībā uz proteāzes K fermenta koncentrāciju, kas tiek izmantota dažādos protokolos, var teikt, ka tā ir ļoti dažāda.

To var izmantot no ļoti zemām koncentrācijām (5 µg / ml) līdz koncentrācijām 500 µg / ml. Bet visizplatītākās darba koncentrācijas ir robežās no 50 līdz 100 μg / ml, īpaši olbaltumvielu sagremšanai un nukleāzes inaktivācijai. Lai gan audu ārstēšanai nepieciešama koncentrācija 2 mg / ml.

Lietojumprogrammas

Tās pielietojums ir ļoti plašs, un to var apkopot šādi:

-To izmanto olbaltumvielu šķelšanā un DNS ekstrahēšanā ar dažādām metodēm, piemēram: sālīšana, PK-SDS, cetil-trimetil-amonija bromīds (CTAB), modificēts kālija acetāts un ekstrakcija ar nātrija jodīdu.

-Nukleāžu (RNāzes un DNāzes) inaktivācija.

- In situ hibridizācijas tehnikā (HIS) papildus nevēlamo olbaltumvielu izvadīšanai, lai veicinātu nukleīnskābes izdalīšanos.

-Olbaltumvielu modifikācija.

-Pētniecības līmenī, dažādos pētījumos.

Proteināzes K priekšrocības

Ir veikti vairāki salīdzinoši pētījumi starp DNS ekstrakcijas paņēmieniem, kuros tiek izmantota proteināze K, ar citiem, kas to neizmanto, un visi secina, ka fermenta lietošanā ir lielāki ieguvumi. Priekšrocības ir šādas:

- Tiek iegūta augstas molekulmasas, augstas kvalitātes un tīrības DNS.

-Ekstrahētais DNS ir stabils līdz 3 mēnešiem.

Izņemto DNS var izmantot šādās metodēs: Southern blot, polimerāzes ķēdes reakcija (PCR), elektroforēze, cita starpā.

Proteināzes K rezistenti proteīni

Dažādos pētījumos secināts, ka prioni (neparasti toksiski PrPSc proteīni) atšķiras no PrPC (dabiskajiem) proteīniem ar izturību pret proteināzes K darbību, bet PrPC ir jutīgi pret tā darbību.

Citi autori ir aprakstījuši, ka PrPSc struktūrā ir jutīgas daļas, bet citi ir izturīgi pret proteināzi K. Tomēr abas daļas ir vienādi toksiskas un infekciozas.

No otras puses, Bastians et al., 1987. gadā no Spiroplasma mirum sugas izdalīja 4 olbaltumvielas ar 28, 30, 66 un 76 kda. Tika konstatēts, ka visi ir izturīgi pret proteināzes K darbību, un tiem bija arī krusteniska reakcija ar dažiem prioniem.

Ir zināms, ka šī suga var izraisīt kataraktu un būtiskus neiroloģiskus bojājumus, un Bastian zinātnisko atradumu dēļ citu pētījumu starpā ir mēģināts saistīt šo mikroorganismu ar transmisīvajām sūkļveida encefalopātijām.

Tomēr šodien šīs deģeneratīvās neiroloģiskās patoloģijas etioloģiju turpina piedēvēt prioniem.

Šajā nozīmē Butlers un citi 1991. gadā identificēja un raksturoja olbaltumvielu klasi, kas izturīga pret proteināzi K 40 kda apjomā no diviem Mycoplasma hyorhinis celmiem. Šis patogēns ietekmē cūkas, inficējot to audus, taču šajā gadījumā ar pārbaudītajiem prioniem nebija savstarpējas reakcijas.

Nepieciešami vairāk pētījumu, lai noskaidrotu daudzus nezināmos šajā sakarā.

Atsauces

1. Bastian F, Jennings R un Gardner W. 1987. Antiserum pret skrepi saistīto fibrillu olbaltumvielām krusteniski reaģē ar Spiroplasma miru m fibril proteīniem. J. Klin. Mikrobiols. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. DNS ekstrakcijas un attīrīšanas metodes novērtējums no neidentificētu līķu formaldehīdā fiksētiem muskuļu audiem. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42–49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, un Mcgarrity G. Proteinase K-Resistente Proteins Identification and Characterization of Proteinase K-Resistente Proteinase K-Resistente Proteinase K-Resistente Proteinase K-Resistente Proteinase K-resistento olbaltumvielu identifikācija un raksturojums klases molikūtos. Infekcija un imunitāte, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Divu aksēna barotnē audzētu divu Trypanosoma cruzi DNS ekstrakcijas protokolu salīdzinājums. Peru sv. Med., Sabiedrības veselība 2014; 31 (2): 222–227. Pieejams vietnē: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E un Palma W. Piecu DNS ekstrakcijas protokolu efektivitātes noteikšana no parafinēta materiāla molekulāriem pētījumiem. Rev Méd Univ Kostarika. 2007; 1 (1): 10-19.