ENDONUKLEĀZES: FUNKCIJAS, VEIDI UN PIEMĒRI - BIOLOĢIJA - 2025

The endonucleases ir fermenti, kas pērtiķa phosphodiester saites, kas atrodas robežās no nukleotīdu ķēdes. Endonukleāzes restrikcijas vietas ir ļoti dažādas. Daži no šiem fermentiem gandrīz visur sagriež DNS (dezoksiribonukleīnskābi, mūsu ģenētisko materiālu), tas ir, tie nav specifiski.

Turpretī ir vēl viena endonukleāžu grupa, kas ir ļoti specifiski šķeltajā reģionā vai secībā. Šī enzīmu grupa ir pazīstama kā restrikcijas enzīmi, un tie ir ļoti noderīgi molekulārajā bioloģijā. Šajā grupā mums ir labi zināmie enzīmi Bam HI, Eco RI un Alu I.

Endonukleāzes sagriež DNS iekšēji.
Avots: pixabay.com

Pretstatā endonukleāzēm, ir arī cits katalītisko olbaltumvielu veids - eksonukleāzes -, kas ir atbildīgas par fosfodiestera saišu pārrāvumu ķēdes beigās.

Restrikcijas endonukleāzes

Restrikcijas endonukleāzes vai restrikcijas enzīmi ir katalītiski proteīni, kas ir atbildīgi par fosfodiestera saišu šķelšanu DNS ķēdē ļoti specifiskās secībās.

Šos fermentus var iegādāties no vairākiem biotehnoloģiju uzņēmumiem, un to izmantošana ir gandrīz būtiska pašreizējās DNS manipulācijas metodēs.

Restrikcijas endonukleāzes tiek nosauktas, izmantojot tā organisma binomiskā zinātniskā nosaukuma pirmos burtus, no kura tie ir nākuši, kam seko celms (tas nav obligāts) un beidzas ar restrikcijas enzīmu grupu, pie kuras tie pieder. Piemēram, Bam HI un Eco RI ir plaši izmantotas endonukleāzes.

DNS reģionu, ko enzīms atpazīst, sauc par restrikcijas vietu un ir unikāls katrai endonukleāzei, lai gan vairāki fermenti var sakrist restrikcijas vietās. Šī vietne parasti sastāv no īsas palindromiskas secības, kuras garums ir apmēram 4 līdz 6 bāzes pāri, piemēram, AGCT (Alu I) un GAATTC Eco RI.

Palindromiskās secības ir secības, kuras, kaut arī lasītas virzienā no 5 'līdz 3' vai 3 'līdz 5', ir identiskas. Piemēram, Eco RI gadījumā palindromiskā secība ir šāda: GAATTC un CTTAAG.

Restrikcijas endonukļu funkcijas un pielietojumi

Par laimi molekulārajiem biologiem, baktērijas evolūcijas gaitā ir izstrādājušas virkni restrikcijas endonukleāžu, kas iekšēji fragmentē ģenētisko materiālu.

Dabā šie enzīmi, iespējams, ir attīstījušies kā baktēriju aizsardzības sistēma pret svešu DNS molekulu, piemēram, fāgu, iebrukumiem.

Lai atšķirtu vietējo un svešo ģenētisko materiālu, šīs restrikcijas endonukleāzes var atpazīt specifiskas nukleotīdu secības. Tādējādi baktēriju iekšienē var netraucēt DNS, kurai nav šīs secības.

Turpretī, kad endonukleāze atpazīst restrikcijas vietu, tā saistās ar DNS un sagriež to.

Biologi ir ieinteresēti izpētīt dzīvo lietu ģenētisko materiālu. Tomēr DNS veido vairāku miljonu bāzes pāri. Šīs molekulas ir ārkārtīgi garas, un tās jāanalizē mazos fragmentos.

Lai sasniegtu šo mērķi, restrikcijas endonukleāzes tiek integrētas dažādos molekulārās bioloģijas protokolos. Piemēram, atsevišķu gēnu var notvert un replicēt turpmākai analīzei. Šo procesu sauc par gēna "klonēšanu".

Ierobežojuma fragmenta garuma polimorfisms (RFLP)

Restrikcijas fragmenta garuma polimorfismi attiecas uz specifisku nukleotīdu secību shēmu DNS, kuras restrikcijas endonukleāzes spēj atpazīt un sagriezt.

Pateicoties fermentu specifikai, katram organismam ir raksturīgs īpašs DNS griešanas modelis, kura izcelsme ir dažāda garuma fragmenti.

Restrikcijas endonukleāžu veidi

Vēsturiski restrikcijas endonukleāzes ir klasificētas trīs enzīmu veidos, kas apzīmēti ar romiešu cipariem. Nesen tika aprakstīts ceturtais endonukleāzes veids.

I tips

I tipa endonukleāžu vissvarīgākā īpašība ir tā, ka tās ir olbaltumvielas, kas sastāv no vairākām apakšvienībām. Katra no šīm funkcijām darbojas kā viens olbaltumvielu komplekss, un parasti tai ir divas apakšvienības, kuras sauc par R, divām M un vienu S.

S daļa ir atbildīga par restrikcijas vietas atpazīšanu DNS. Savukārt R apakšvienība ir būtiska šķelšanai, un M ir atbildīga par metilēšanas reakcijas katalizēšanu.

Ir četras I tipa enzīmu apakškategorijas, kuras pazīstamas ar burtiem A, B, C un D, ​​kuras parasti izmanto. Šīs klasifikācijas pamatā ir ģenētiskā komplementācija.

I tipa fermenti bija pirmās restrikcijas endonukleāzes, kas tika atklātas un attīrītas. Tomēr visnoderīgākie molekulārajā bioloģijā ir II tips, kas tiks aprakstīts nākamajā sadaļā.

II tips

II tipa restrikcijas endonukleāzes atpazīst specifiskas DNS sekvences un šķelšanos nemainīgā stāvoklī tuvu sekvencei, kas rada 5 'fosfātus un 3' hidroksilus. Parasti par kofaktoriem nepieciešami magnija joni (Mg ²⁺ ), taču ir arī daži, kuriem ir daudz specifiskākas prasības.

Strukturāli tie var parādīties kā monomēri, dimēri vai pat tetrameri. Rekombinantā tehnoloģija izmanto II tipa endonukleāzes, un šī iemesla dēļ ir raksturoti vairāk nekā 3500 fermenti.

III tips

Šīs fermentatīvās sistēmas sastāv no diviem gēniem, ko sauc par mod un res un kuri kodē apakšvienības, kas atpazīst DNS, kā arī modifikācijas vai ierobežojumus. Abas subvienības ir nepieciešamas ierobežošanai, process ir pilnībā atkarīgs no ATP hidrolīzes.

Lai sašķeltu DNS molekulu, fermentam jādarbojas mijiedarbībā ar divām palindromiskās atpazīšanas sekvences kopijām, un vietām substrātā jābūt apgrieztā orientācijā. Pirms šķelšanās notiek DNS translokācija.

IV tips

Pēdējā laikā ir noteikta papildu grupa. Sistēma sastāv no diviem vai vairākiem gēniem, kas kodē olbaltumvielas, kas šķeļ tikai modificētas DNS sekvences, vai nu metilētas, hidroksimetilētas, vai hidrometilētas glikozilgrupas.

Piemēram, ferments EckKMcrBC atpazīst divus RinC vispārējās formas dinukleotīdus; purīns, kam seko metilēts citozīns, kuru var atdalīt ar vairākiem bāzes pāriem - no 40 līdz gandrīz 3000. Šķelšana notiek apmēram 30 bāzes pāru pēc vietas, kuru ferments atpazīst.

V tipa endonukleāzes

Šāda veida endonukleāzes sauc arī par "kodējošām" endonukleāzēm. Šie fermenti atpazīst un sagriež mērķa DNS secību unikālās genoma vietās no 14 līdz 40 bp.

Šie fermenti bieži tiek kodēti intronos, un tiek uzskatīts, ka to funkcija veicina sagrieztu sekvenču horizontālu pārnešanu. Pēc griešanas DNS dubultā spirālē notiek pārtraukuma labojums, pamatojoties uz komplementāro secību.

Piemēri

E. coli endonukleāze I darbojas kā aizsardzības sistēma pret fāgiem un parazītiem. Tas atrodas galvenokārt starp citoplazmas membrānu un šūnas sienu. Tas rada divpusējus pārtraukumus svešā DNS, ar kuru tā mijiedarbojas periplasmiskajā telpā.

CRISPR-Cas endonukleāzes ir fermenti, kas iedarbojas uz daudzu baktēriju veidu aizsardzības mehānismu. Tie identificē un izgriež īpašas DNS sekvences no okupējošajiem organismiem, kas parasti ir vīrusi.

Nesen Masačūsetsas Tehnoloģiju institūta (MIT) pētnieki ar augstu precizitāti atklāja CRISPR-Cas12bm genoma rediģēšanas sistēmu cilvēka šūnu modificēšanai.

Atsauces

1. Burrell, MM (Red.). (1993). Molekulārās bioloģijas fermenti. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA un Wilson, GG (2013). I tipa restrikcijas enzīmi un to radinieki. Nukleīnskābju izpēte, 42 (1), 20–44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS un Pfaller, MA (2017). Medicīniskā mikrobioloģija + StudentConsult spāņu valodā + StudentConsult. Elsevier veselības zinātnes.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restrikcijas endonukleāzes DNS molekulu analīzē un pārstrukturēšanā. Gada bioķīmijas pārskats, 44 (1), 273–293.
5. Pingouds, A., Fuksīters, M., Pingouds, V., & Wende, W. (2005). II tipa restrikcijas endonukleāzes: struktūra un mehānisms. Šūnu un molekulārās dzīvības zinātnes, 62 (6), 685.