IMŪNFLUORESCENCE: PAMATOJUMS, PROTOKOLS UN LIETOJUMPROGRAMMAS - BIOLOĢIJA - 2025

Immunofluorescence ir spēcīgs paņēmiens imūnkrāsošanas izmantojot antivielas, kas kovalenti saistīta luminiscences molekulām, lai noteiktu īpašus mērķus šūnu paraugu, kas piestiprināts cietas.

Šis paņēmiens ietver mikroskopisku novērošanu ar imunoloģisko specifiskumu, ļaujot novērot dzīvas vai mirušas šūnas, kas var uzrādīt niecīgu daudzumu antigēnu. To plaši izmanto gan pētījumu jomā, gan dažādu patoloģiju klīniskajā diagnostikā.

Aktīna pavedienu imūno marķēšana kardiomiocītu šūnās (Avots: Ps1415, izmantojot Wikimedia Commons)

Šis paņēmiens, galvenokārt kvalitatīvs (ar dažiem kvantitatīviem variantiem), ir īpaši saistīts ar parauga vizualizāciju ar fluorofora produkta signālu, kas ir fluorescējoša molekula, kas piesaistīta antivielai un kuru var ierosināt noteiktā viļņa garumā. .

Šūnu kontekstā ir ļoti noderīgi izpētīt olbaltumvielu esamību / neesamību un subcelulāro atrašanās vietu. Sākotnēji šo paņēmienu izmantoja vīrusu, piemēram, gripas, diagnostikā un pēc tam daudzu citu infekcijas slimību diagnosticēšanai.

Tas ir ļoti jutīgs paņēmiens, un ar atbilstošu mikroskopijas aprīkojumu tam var būt ļoti laba izšķirtspēja. Tā novērošanai ir jāizmanto konfokālie vai epifluorescences mikroskopi.

Tomēr, neskatoties uz to, ka tas ir ļoti populārs, tas var radīt dažas svarīgas problēmas saistībā ar nespecifiskas fluorescences iegūšanu, kas rada zināmu fona “troksni”, kas bieži vien ierobežo atbilstošu rezultātu nolasīšanu.

Pamats

Imūnfluorescences pamatā ir mijiedarbības reakcijas starp antivielu un antigēnu bioloģiskās parādības izmantošana. Tas ir īpaši saistīts ar šīs reakcijas vizualizāciju vai noteikšanu, izmantojot aizraujošas fluorescējošas molekulas līdz noteiktam viļņa garumam.

Antiviela ir imūnglobulīna proteīns, kas izdalās no aktīvajām B šūnām un ir īpaši izveidots pret antigēnu, pie kura tas var saistīties ar lielu afinitāti un specifiskumu. Imūnfluorescencē tiek izmantoti IgG imūnglobulīni, kas šķīst asins serumā.

Antivielas ir molekulas līdz 950 kDa, ko veido divas īsas (vieglas) un divas garas “Y” formas (smagas) peptīdu ķēdes. Gan vieglā, gan smagā ķēde ir sadalīta divos domēnos: viens mainīgais, kas spēj atpazīt antigēnu, un otrs, nemainīgs vai konservēts, raksturīgs katrai sugai.

Antigēni tiek funkcionāli definēti kā molekulas, kuras var atpazīt antivielas, un tās lielākoties ir olbaltumvielas. Kad dzīvnieks tiek pakļauts antigēnam, tiek aktivizēti imūnsistēmas limfocīti, kas ražo pret to specifiskas antivielas un darbojas kā aizsardzības sistēma.

Antigēnam, piemēram, proteīnam, var būt vairāk nekā viens epitops vai antivielas atpazīšanas vieta, lai dzīvnieka serumā, kas pakļauts antigēnam, varētu būt poliklonālas antivielas pret viena un tā paša proteīna dažādiem reģioniem.

Pēc tam imūnsistēmas fluorescence izmanto dzīvnieka spēju radīt poliklonālas antivielas pret īpašu antigēnu, lai to attīrītu un pēc tam izmantotu tā paša antigēna noteikšanai citos kontekstos.

Starp fluorescējošām krāsvielām vai molekulām, kuras visvairāk izmanto dažām imūnsistēmas fluorescences metodēm, ir fluoresceīna izotiocianāts (FITC), tetrametilrodamīna izotiocianāts-5 un 6 (TRITC), daudzi cianīni, piemēram, Cy2, Cy3, Cy5 un Cy7, un krāsvielas, ko sauc par Alexa Fluor®. , piemēram, Alexa Fluor®448.

Protokols

Imūnfluorescences protokols mainās atkarībā no daudziem faktoriem, tomēr kopumā tas ietver lineāru soļu secību, kas sastāv no:

• Plākšņu un šūnu sagatavošana
• Paraugu fiksēšana
• Permeabilizācija
• Bloķēšana
• Imūnās vai imūnās krāsas
• Montāža un novērošana

-Sagatavošana

No paraugiem

Paraugu sagatavošana būs atkarīga no to rakstura un veicamās pieredzes veida. Zemāk tiks paskaidrots vienkāršākais gadījums, kas saistīts ar šūnu izmantošanu suspensijā.

Šūnas suspensijā, tas ir, šķidrā barotnē, vispirms no tās jānodala ar centrifugēšanu un pēc tam jāmazgā ar buferšķīdumu vai izosmotisko "buferi", kas saglabā to integritāti.

Parasti izmanto fosfāta un fizioloģiskā šķīduma buferšķīdumu, kas pazīstams kā PBS, kurā šūnas tiek atkārtoti suspendētas un šo maisījumu atkal centrifugē, lai šūnās nebūtu barotnes, kurā var būt traucējošas vielas.

No asmeņiem

Rūpīgi jāsagatavo arī priekšmetstikliņi, ko izmanto mikroskopiskai novērošanai, kur šūnas vēlāk tiks fiksētas attiecīgajai pakārtotajai apstrādei.

Tie ir pārklāti vai "sensibilizēti" ar poli-lizīna, sintētiska polimēra, šķīdumu, kas darbosies kā "molekulārā līme" starp šūnām un cieto atbalstu, pateicoties elektrostatiskajai mijiedarbībai starp to aminogrupu pozitīvajiem lādiņiem un negatīvās lādītes olbaltumvielām, kas pārklāj šūnas

Paraugu fiksēšana

Šis process sastāv no šūnā atrodamo olbaltumvielu imobilizācijas, lai neskartu to telpisko atrašanās vietu. Izmantotajām molekulām jāspēj šķērsot visu veidu šūnu membrānas un ar kovalentiem proteīniem veidot režģus.

Plaši izmanto formaldehīdu un paraformaldehīdu, glutaraldehīdu un pat metanolu, ar kuriem šūnu paraugus noteiktu laiku inkubē un pēc tam mazgā ar izosmotisko buferšķīdumu.

Pēc šūnu nostiprināšanas tās turpina piestiprināt ar iepriekš sensibilizētām loksnēm ar poli-lizīnu.

Permeabilizācija

Atkarībā no veicamā testa veida būs jāpārbauda pētāmās šūnas vai nē. Ja tiek mēģināts zināt noteikta proteīna atrašanās vietu, klātbūtni vai neesamību uz šūnas virsmas, permeabilizācija nebūs nepieciešama.

No otras puses, ja vēlaties uzzināt olbaltumvielu atrašanās vietu šūnā, permeabilizācija ir būtiska, un tā sastāv no paraugu inkubēšanas ar Triton X-100 - mazgāšanas līdzekli, kas spēj caurlaidēt šūnu membrānas.

Bloķēšana

Būtisks solis visās imunoloģiskajās metodēs ir bloķēšana. Šajā procedūras posmā bloķēšana nozīmē, ka sensibilizētās loksnēs visas vietas tiek pārklātas ar poli-lizīna molekulām, kurām šūnas nav pielipušas. Tas ir, tas novērš jebkādu nespecifisku savienību.

Parasti bloķēšanai izmanto šķīdumus ar liellopu seruma albumīnu (BSA) PBS buferī, un labākos rezultātus iegūst, jo ilgāks inkubācijas laiks ar šo šķīdumu. Pēc katras darbības, ieskaitot bloķēšanu, ir nepieciešams nomazgāt atlikušo šķīdumu.

Imūnās vai imūnās krāsas

Imūnkrāsošanas vai imūnkrāsošanas procedūra galvenokārt būs atkarīga no tā, vai tā ir tieša vai netieša imūnfluorescence (skatīt zemāk).

Ja tā ir primāra vai tieša imunofluorescence, paraugus inkubē ar vēlamajām antivielām, kuras jāsavieno ar fluorescējošām krāsvielām. Inkubācijas procedūra sastāv no antivielas atšķaidīšanas šķīdumā, kas saturēs arī BSA, bet mazākā proporcijā.

Ja runa ir par sekundāru vai netiešu imūnsistēmas fluorescenci, jāveic divas secīgas inkubācijas. Vispirms ar vēlamajām antivielām un pēc tam ar antivielām, kas spēj noteikt primāro imūnglobulīnu nemainīgos reģionus. Tieši šīs sekundārās antivielas ir kovalenti saistītas ar fluoroforiem.

Metode ir ļoti daudzpusīga, kas ļauj vienlaikus marķēt vairāk nekā vienu antigēnu vienā paraugā, ja tiešās imūnfluorescences gadījumā ir primārās antivielas, kas savienotas ar dažādiem fluoroforiem.

Vienlaicīgai marķēšanai netiešā imunofluorescencē ir jāpārliecinās, ka katru primāro antivielu ražo atšķirīgs dzīvnieks, kā arī to, ka katra sekundārā antiviela ir savienota ar atšķirīgu fluoroforu.

Tāpat kā bloķēšana, inkubācija ar antivielām dod labākus rezultātus, jo ilgāks laiks. Pēc katras darbības ir jānomazgā liekās antivielas, kas nesaistījās ar paraugiem, un sekundārajā imunofluorescencē pirms sekundārās antivielas pievienošanas tas ir jānobloķē.

Noteiktos paņēmienos tiek izmantoti citi traipi, kas nav saistīti ar imūno krāsošanu, piemēram, kodola DNS krāsošana ar DAPI fluoroforu.

Montāža un novērošana

Pēdējā inkubācijas laikā ar fluoroforiem paraugiem jāpaliek tumsā. Novērošanai mikroskopā parasti izmanto dažas vielas, lai saglabātu fluoroforu fluorescenci, kas savienoti ar antivielām.

Veidi

Tiešas un netiešas imūnfluorescences grafiskais kopsavilkums (Avots: Westhayl618 caur Wikimedia Commons)

Tieša vai primāra imunofluorescence

Tam ir sakars ar antigēnu noteikšanu, izmantojot fluorescējošas antivielas. Šīs tehnikas izmantošanas galvenā priekšrocība ir tās ātrums, tomēr šajā procesā var rasties daudzi nespecifiskas saistīšanās gadījumi, īpaši pētot cilvēka serumus, jo tie ir bagāti ar ļoti neviendabīgām antivielām.

Netieša vai sekundāra imūnfluorescence

To sauc arī par "sviestmaižu" paņēmienu, un tas ietver tehnikas attīstību divos posmos. Pirmais ir saistīts ar nefluorescējošas antivielas izmantošanu un tās saistīšanos ar interesējošo antigēnu.

Pret šīs pirmās antivielas nemainīgo reģionu (kas tagad kalpos kā antigēns) tiek izmantota otra antiviela, kas to spēj atpazīt, un kas ir saistīta ar fluorescējošu molekulu.

Fluorescējoša signāla parādīšanās būs īpašas atpazīšanas rezultāts starp pirmo nefluorescējošo antivielu un interesējošo antigēnu; šīs pirmās antivielas klātbūtne ietekmē tās otrās antivielas klātbūtni, kura ir marķēta un kuras dēļ var noteikt antigēna klātbūtni vai neesamību.

Neskatoties uz to, ka šī metode ir daudz laikietilpīgāka nekā tieša imunofluorescence (jo tā ietver vēl vienu inkubācijas soli), šī metode neietver fluorescējošas antivielas konstruēšanu katram pētāmajam antigēnam, kā rezultātā ekonomiskajā ziņā dzīvotspējīgāks.

Turklāt tas ir jutīgāks paņēmiens signāla pastiprināšanas ziņā, jo vairāk nekā viena sekundārā antiviela var saistīties ar primārās antivielas nemainīgo reģionu, tādējādi pastiprinot fluorescējošā signāla intensitāti.

Lietojumprogrammas

Kā jau iepriekš tika atzīmēts, imūnfluorescence ir ārkārtīgi daudzveidīga tehnika, ko zinātnes un klīniskajā jomā izmanto daudzos veidos. To var izmantot, lai atbildētu uz ekoloģiskiem, ģenētiskiem un fizioloģiskiem jautājumiem attiecībā uz daudziem organismiem.

Starp klīniskajiem pielietojumiem to izmanto dažu dermatoloģisku slimību tiešai diagnosticēšanai, izmantojot vai nu tiešu, vai netiešu imūnfluorescenci uz pētāmo pacientu epitēlija audiem.

Vienšūnu organismu, piemēram, rauga, imūnfluorescences paņēmieni ir bijuši pieejami, lai vizualizētu intrakodolu un citoplazmas mikrotubulus, aktīnu un saistītos proteīnus, 10 nm pavedienus un citas citoplazmas, membrānas un šūnu sienas sastāvdaļas.

Atsauces

1. Abcam, imūncitoķīmija un imūnfluorescences protokols. Izgūts no abcam.com
2. Grefs, C. (2012). Fluorescējošas krāsas. Izgūts no vietnes leica-microsystems.com
3. Millers, DM, & Shakest, DC (1995). Imūnfluorescences mikroskopija. In Methods in Cell Biology (48. sēj., 365. – 394. Lpp.). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Imūnfluorescences paņēmieni. Journal of Investigative Dermatology, 133., 1. – 4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Rauga imūnfluorescences metodes. In Enzymology Methods of Enzymology (194. sēj., 565. – 602. Lpp.). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Imūnfluorescences pielietojumi sabiedrības veselības virusoloģijā. Bakterioloģiskie pārskati, 28. (4), 402. – 408.
7. Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996). Imūnfluorescence fitoplanktona izpētē: pielietojums un potenciāls. J: Phycol. , 32, 1–16.