BAKTĒRIJU UZTRIEPE: RAKSTUROJUMS UN SAGATAVOŠANA - BIOLOĢIJA - 2025

Baktēriju uztriepes ir plānas plēves uztriepes no suspensijas bakteriālu mikroorganismu, kas tiek veikts uz caurspīdīga stikla plāksnes vai slide, novērošanai saskaņā ar gaismas mikroskopu.

Pagarināšana plēves veidā tiek veikta, lai pēc iespējas vairāk atdalītu mikroorganismus, jo, ja tie ir sagrupēti, novērojums nav skaidrs.

1. attēls. Baktēriju uztriepe, kas redzama ar skenējošu elektronu mikroskopu. Avots: pixbay.com

Baktēriju kultūru izpētē to labākai analīzei tiek izmantotas uztriepes sagatavošanas, fiksēšanas un krāsošanas metodes. Tā kā mikroorganismi ir mazi, to novērošanai obligāti jāizmanto optiskais mikroskops.

Optiskie mikroskopi ir svarīgi instrumenti uztriepes novērošanai. Tajos ir izmantotas optiskās lēcas un gaisma, kas ļauj paraugus aplūkot ar lielu palielinājumu.

Kopumā dzīvām šūnām nav lielākoties krāsainu struktūru, ar gaismas mikroskopu tās ir bezkrāsainas, caurspīdīgas, un tām ir ļoti mazs iekšējais kontrasts un ar apkārtējo vidi.

Novērošana ar vienkāršu gaismas lauka mikroskopu, neizmantojot krāsošanas palīgmetodes, ir ļoti ierobežota, un to izmanto tikai dažos gadījumos, piemēram, mikroorganismu kustības novērošanā.

Lai optimāli novērotu mikroorganismus, ir jāatrod līdzsvars starp kontrastu un izšķirtspēju. Šūnu detaļas nevar redzēt mikroskopā, pat ar augstu izšķirtspēju; Krāsvielas ir jāizmanto, izmantojot krāsošanas paņēmienus, kas nodrošina kontrastu novērošanai.

Labas kvalitātes baktēriju uztriepes raksturojums

Lielisks kontrasts

Lai sasniegtu izcilu kontrastu, ir sarežģīti mikroskopi, kurus sauc par fāzu kontrasta mikroskopiem, diferenciālu traucējumu mikroskopiem un tumšā lauka mikroskopiem. Šāda veida mikroskopu izmanto, lai novērotu baktēriju struktūras, piemēram, apvalkus un pavedienus, cita starpā.

Krāsošana ir vienkārša tehnika kontrasta palielināšanai, kas tiek panākta ar gaišā lauka mikroskopu. Šajā tehnikā var izmantot dažādus traipus, kas ievērojami uzlabo mikroskopisko novērošanu.

Traipus veic tieši uz priekšmetstikliņos esošo mikroorganismu suspensiju uztriepes vai pagarinājumiem, iepriekš žāvētas un fiksētas.

Labs labojums

Fiksācija ir paņēmiens, ko izmanto šūnu struktūru saglabāšanai; izraisa mikroorganismu inaktivāciju un saķeri ar priekšmetstikliņa stiklu. Ir dažādas fiksācijas procedūras: termiskā fiksācija un ķīmiskā fiksācija.

Siltuma fiksācija

Šī ir visplašāk izmantotā baktēriju uztriepes novērošanas metode. Metode sastāv no uztriepes baktēriju suspensijas izlaišanas caur šķiltavu liesmu. Šis paņēmiens spēj saglabāt baktēriju ārējo morfoloģiju, bet iznīcina to iekšējās struktūras.

Ķīmiskā fiksācija

Ķīmiskajā fiksācijā cita starpā izmanto konservēšanas ķimikālijas, piemēram, formaldehīdu vai formalīnu, etanolu un etiķskābi. Ķīmisko fiksējošo līdzekļu lietošanas priekšrocība ir tā, ka tiek panākta mikroorganismu iekšējo šūnu struktūru saglabāšana.

2. attēls. Asins uztriepe. Avots: Bobjgalindo, no Wikimedia Commons

Laba iekrāsošana

Visizplatītākās procedūras iepriekš izžuvušas un fiksētas uztriepes krāsošanai ir pozitīva vai vienkārša, diferencēta un negatīva. Pastāv arī īpašas metodes noteiktu šūnu struktūru (kapsulas, sporas, flagellas) krāsošanai.

Pozitīva vai vienkārša krāsošana

Pozitīva vai vienkārša krāsošana ir visizplatītākā uztriepes krāsošanas metode. Tajā tiek izmantotas krāsvielas, kurām piemīt spēja saistīties ar noteiktām mikrobu struktūrām, ļaujot tās novērot mikroskopā.

Šīm krāsvielām ir hromoforu grupas (krāsainā daļa) to ķīmiskajā struktūrā ar mainīgām divkāršām saitēm un vienreizējām saitēm (konjugācija). Šīs saites savukārt var izveidot jonu vai kovalentās saites ar dažām šūnu struktūrām.

Krāsvielas, ko izmanto pozitīvā vai vienkāršā krāsošanā, galvenokārt ir anilīna (krāsainu organisko sāļu) ķīmiskie atvasinājumi.

No otras puses, starp krāsvielām mēs varam atrast dažus ar pamata pH, bet citus ar skābu pH.

Pamata krāsvielas

Pamatkrāsās hromoforu grupai ir pozitīvs elektriskais lādiņš. Lielākajai daļai prokariotu mikroorganismu ir neitrāls iekšējais pH, un to šūnu virsma ir negatīvi lādēta. Šīs elektrostatiskās mijiedarbības rezultātā hromofors saistās ar šūnu un krāso to.

Pamata krāsvielu piemēri cita starpā ir metilēnzilā, kristālvioleta, malahīta zaļā, pamata fuscīns, safranīns.

Skābās krāsvielas

Skābās krāsās hromoforu grupai ir negatīvs elektriskais lādiņš. Tos izmanto olbaltumvielu krāsošanai ar pozitīvi uzlādētām aminogrupām. Skābās krāsvielas ir skābes fuscīns, Bengālijas roze, Kongo sarkanais un eozīns.

Diferenciālā krāsošana

Atšķirīgā krāsošanas metode sastāv no divu dažādu krāsu vai intensitātes krāsvielu pielietošanas, lai mikroskopā atšķirtu dažādus mikroorganismus. Bakteroloģijā visbiežāk izmantotie diferenciālie traipi ir Gram un izturība pret skābju un spirtu.

Gram traipu izmanto kā iepriekšēju pārbaudi, lai zinātu formas, lieluma, šūnu grupējumu, kā arī šūnas sienas veidu. Izmantojot Gram traipu testu, šūnu sienas baktērijas tiek klasificētas grampozitīvās un gramnegatīvās baktērijās.

Negatīva krāsošana

Šajā tehnikā tiek izmantotas ķīmiskas krāsvielas, kas neiekļūst šūnas iekšpusē, bet padara barotni, kurā atrodas mikroorganismi, uz melna fona.

Negatīvās krāsošanas metodē uztriepi izgatavo no Indijas tintes piliena vai nigrosīna suspensijas, kas pēc žāvēšanas istabas temperatūrā ļauj necaurspīdīgu plēvi gaismas caurlaidībai. Tādā veidā mikroorganismi parādās kā spilgtas formas uz tumša fona.

Sagatavošana

A. uztriepe

1.- Ļoti labi nomazgājiet priekšmetstikliņus, nosusiniet ar absorbējošu papīru un marķējiet tos. Marķējumā jānorāda preparāta saturs, datums un tās personas vārds, kura to apstrādājusi.

2.- Apgaismojiet šķiltavu un sterilizējiet inokulācijas cilpu liesmā līdz spilgti sarkanai.

3.- Ļaujiet rokturim atdzist.

4.- Paņemiet baktēriju kultūras mēģeni, noņemiet vāciņu un ātri izvadiet mēģenes muti netālu no degļa liesmas (liesmas).

5.- Ieduriet inokulācijas cilpu mēģenē, kurā atrodas baktēriju kultūra, un ņemiet paraugu.

6.- Ja kultūra ir šķidrā vidē, paraugu, kas ņemts ar rokturi, novieto priekšmetstikliņa centrā un uzmanīgi izklāj apmēram 2 cm diametra aplī.

7.- Sterilizējiet inokulācijas cilpu vēlreiz.

8.- Ļaujiet uztriepei nožūt gaisā.

9.- Atkārtojiet 3. līdz 8. darbību trīs reizes.

10.- Ja kultūra ir cietā barotnē, uz priekšmetstikliņa iepriekš jānovieto destilēta ūdens piliens. To veic, lai sajauktu nelielu kultūras paraugu ar inokulācijas cilpu, kā norādīts 2. līdz 5. solī (aseptiski apstākļi).

11.- Izklājiet atšķaidīto paraugu ar ūdens pilienu uz priekšmetstikliņa un atkārtojiet trīs reizes.

B. Fiksācija

1.- Pievienojiet divus pilienus metanola vai absolūtā etanola sausajām uztriepes - no kultūrām šķidrā vidē.

2.- Ļaujiet gaisam izžūt no šķiltavas.

3.- Ja uztriepes nāk no kultūras cietā barotnē, tad sauso uztriepi nostiprina ar karstumu, 2–3 reizes ātri to izlaižot caur vieglāku liesmu karstāko daļu.

4.- Pieskarieties uztriepes apakšējai daļai ar kreisās rokas muguras daļu (labajām rokām; pretējā gadījumā izmantojiet labo roku) un pārbaudiet, vai tā ir auksta.

C. Vienkārša krāsošana

1.- Uztriepei pievieno 2 pilienus izvēlētā traipa un ļauj tam iedarboties tik ilgi, cik vajadzīgs katram traipam paredzētajos īpašajos protokolos (parasti no 1 līdz 5 minūtēm).

2.- Dažiem traipiem to aktivizēšanai ir nepieciešams izmantot siltumu, un tādā gadījumā jābūt ļoti uzmanīgiem, sildot priekšmetstikliņu šķiltavu liesmā (manipulējiet ar pinceti un izvairieties no vārīšanās). Uztriepes pārkaršana var iznīcināt novērojamās šūnas.

3.- Noņemiet krāsvielas pārpalikumu, mazgājot ar destilētu ūdeni no pikseta. Izņemiet mazgājamo ūdeni, viegli piesitot priekšmetstikliņam uz tā malas, noliecot uz darba galda.

4.- Ļaujiet gaisa žāvēšanai.

5.- Atkarībā no novērojuma veida šajā posmā tiek izmantots vai netiek izmantots pārsegs. Apvārsnis aizsargā un saglabā uztriepi. Ja šajā posmā tiek veikts eļļas iegremdēšanas novērojums, neizmanto pārseguma lūpas, bet uztriepi nevar saglabāt.

D. Uztriepes pilnīga saglabāšana

1.- Uztriepi pēc kārtas vismaz 5 minūtes iegremdē katrā no zemāk norādītajiem šķīdumiem. Šo "vannu" mērķis ir pilnībā dehidrēt uztriepi. Pirms uztriepes ievadīšanas nākamajā vannā, katrs reaģents ir rūpīgi jāiztukšo.

Dehidrējošo vannu secība ir šāda:

1. 70% etanols
2. 95% etanols
3. Tīrs acetons
4. Acetona-ksilola 1: 1 maisījums
5. Ksilols

Pēc tam ļauj nožūt gaisā.

2.- Uzstādiet pārsega slīdni, vēlams 22 × 22 mm, izmantojot Kanādas balzamu vai citu montāžas līdzekli.

Atsauces

1. Briggs, G. (1965). Cēloņu faktori mikrobioloģisko laboratoriju negadījumos un infekcijās. ASV armijas bioloģiskās laboratorijas. Forttriks.
2. Kapučīno, JG un Welch, CT (2017). Mikrobioloģija: laboratorijas rokasgrāmata. Pīrsons.
3. Holts, JG redaktors. (1977). Īsākā Bergeja rokasgrāmata par determinējošo bakterioloģiju. 8 ^th Baltimore: Williams un Wilkins Co.
4. Džonsons, TR un Case; CL (2018). Laboratorijas eksperimenti mikrobioloģijā. Pīrsons.
5. Tille, P. (2017). Diagnostiskā mikrobioloģija. 14 ^th St Louis, ASV: Elsiever, Inc.